Двухланцуговая РНК (dsRNA) ELISA KIT

Гэты набор уяўляе сабой імунаферментны аналіз (ІФА), спалучаны з сістэмай біятын-стрэптавідын, для колькаснага вымярэння дцРНК даўжынёй больш за 60 пар асноў (п.н.), незалежна ад паслядоўнасці.Пласціна была папярэдне пакрыта антыцеламі супраць dsRNA.dsRNA, якая прысутнічае ва ўзоры, дадаецца і звязваецца з антыцеламі, пакрытымі лункамі.Затым біятыніляванае антыцела супраць дцРНК дадаецца і звязваецца з дцРНК ва ўзоры.Пасля прамывання дадаецца HRP-стрэптавідын, які звязваецца з біятыніляваным антыцелам супраць дцРНК.Пасля інкубацыі незвязаны ПХ-стрэптавідын змываецца.Затым дадаецца раствор субстрата TMB і каталізуецца HRP для атрымання прадукту сіняга колеру, які змяняецца на жоўты пасля дадання кіслага стоп-раствора.Шчыльнасць жоўтага колеру прапарцыйная мэтавай колькасці дцРНК, захопленай у пласціне.Паглынанне вымяраецца пры 450 нм.

Ужыванне

Гэты набор прызначаны для колькаснага вымярэння рэшткавай дцРНК.

Складнікі камплекта

Захоўванне і стабільнасць

1. Для нявыкарыстанага набору: увесь набор можа захоўвацца пры тэмпературы 2~8 ℃ на працягу тэрміну прыдатнасці.Для стабільнасці захоўвання варта пазбягаць моцнага святла.

2. Для выкарыстанага набору: пасля адкрыцця мікрапланшэта накрыйце нявыкарыстаныя лункі герметыкам для пласцін і вярніце яго ў пакет з фальгі, у якім змяшчаецца асушальнік, зачыніце пакет з фальгі на маланку і як мага хутчэй пасля выкарыстання вярніце тэмпературу да 2~8 ℃.Іншыя рэагенты павінны быць вернуты да 2~8 ℃ як мага хутчэй пасля выкарыстання.

Матэрыялы, неабходныя, але не ўваходзяць у камплект

1. Счытвальнік мікрапланшэтаў з фільтрам 450±10 нм (лепш, калі можна выяўляць на даўжынях хваль 450 і 650 нм).

2. Шэйкер для мікрапланшэтаў.

3. Наканечнікі без РНКаз і цэнтрыфужныя прабіркі.

Блок-схема аперацыі

Перш чым пачаць

1. Давядзіце ўсе кампаненты набору і ўзоры да пакаёвай тэмпературы (18-25 ℃) перад выкарыстаннем.Калі набор не будзе выкарыстаны за адзін раз, дастаньце толькі палоскі і рэагенты для гэтага эксперыменту, а астатнія палоскі і рэагенты пакіньце ў неабходным стане.

2. Буфер для прамывання: развядзіце 40 мл канцэнтраванага буфера для прамывання 20 × 760 мл дэіянізаванай або дыстыляванай вады, каб прыгатаваць 800 мл буфера для прамывання 1 ×.

3. Стандарт: ненадоўга адкруціце або адцэнтрыфугуйце асноўны раствор перад выкарыстаннем.Канцэнтрацыя чатырох прадстаўленых стандартаў складае 5 нг/мкл.Для стандартаў UTP і pUTP dsRNA развядзіце асноўны раствор да 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 пг/мкл буферам STE, каб намаляваць стандартную крывую.Для стандартаў dsRNA N1-Me-pUTP развядзіце асноўны раствор да 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0 пг/мкл буферам STE, каб намаляваць стандартную крывую.Для стандарту 5-OMe-UTP dsRNA развядзіце асноўны раствор да 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0 пг/мкл буферам STE, каб намаляваць стандартную крывую.Мы рэкамендуем, што стандарты могуць быць разведзены ў выглядзе наступных дыяграм:

4. Біятыніляванае антыцела для выяўлення і рабочы раствор HRP-стрэптавідыну: ненадоўга адкруціце або адцэнтрыфугуйце асноўны раствор перад выкарыстаннем.Развядзіце іх да працоўнай канцэнтрацыі буферам для развядзення.

5. Падстаноўка TMB: аспіруйце неабходную дозу раствора стэрылізаванымі наканечнікамі і не вылівайце рэшткі раствора зноў у флакон.Падкладка TMB адчувальная да святла, не падвяргайце падкладку TMB ўздзеянню святла на працягу доўгага часу.

Выкарыстоўваючы пратакол

1. Вызначце колькасць палосак, неабходных для аналізу.Устаўце палоскі ў рамкі для выкарыстання.Астатнія палоскі пласцін, якія не выкарыстоўваліся ў гэтым аналізе, трэба запакаваць у пакет з асушальнікам.Шчыльна зачыніце пакет для захоўвання ў халадзільніку.

2. Дадайце па 100 мкл кожнага з развядзенняў стандарту, пустой пробы і ўзораў у адпаведныя лункі.Накрыйце пластырам.Інкубуйце 1 гадзіну пры пакаёвай тэмпературы з устрэсваннем пры 500 абаротах у хвіліну.Узоры павінны быць разведзены буферам STE да патрэбнай канцэнтрацыі для дакладнага аналізу.

3. Этап прамывання: аспіруйце раствор і прамыйце 250 мкл буфера для прамывання ў кожную лунку і дайце яму пастаяць 30 секунд.Цалкам выкіньце прамывальны буфер, зашчапіўшы пласціну на ўбірае паперу.Усяго памыць 4 разы.

4. Дадайце 100 мкл рабочага раствора біятыніляваных антыцелаў для выяўлення ў кожную лунку.Накрыйце пластырам.Інкубуйце 1 гадзіну пры пакаёвай тэмпературы з устрэсваннем пры 500 абаротах у хвіліну.

5. Паўтарыце этап мыцця.

6. Дадайце 100 мкл працоўнага раствора HRP-стрэптавідыну ў кожную лунку.Накрыйце пластырам.Інкубуйце 30 хвілін пры пакаёвай тэмпературы з устрэсваннем пры 500 абаротаў у хвіліну.

7. Паўтарыце этап мыцця яшчэ раз.

8. Дадайце 100 мкл раствора субстрата TMB у кожную лунку.Накрыйце пластырам.Інкубуйце 30 хвілін пры RT, ахоўвайце ад святла.Пры даданні раствора субстрата вадкасць стане сіняй.

9. Дадайце 50 мкл стоп-раствора ў кожную лунку.Пры даданні стоп-раствора вадкасць стане жоўтай.Затым запусціце счытвальнік мікрапланшэтаў і неадкладна правядзіце вымярэнне пры 450 нм.

Падлік вынікаў

1. Вызначце сярэдняе значэнне дублікатаў для кожнага стандарту, кантролю і ўзораў і адніміце сярэдняе значэнне нулявой стандартнай аптычнай шчыльнасці.Пабудуйце стандартную крывую з абсорбцыяй на вертыкальнай (Y) восі і канцэнтрацыяй дцРНК на гарызантальнай (X）восі.

2. Рэкамендуецца выконваць разлікі з дапамогай камп'ютэрнага праграмнага забеспячэння для падгонкі крывой, такога як curve expert 1.3 або ELISA Calc, у нелінейнай мадэлі з 5 ці 4 параметрамі.

Прадукцыйнасць

1. Адчувальнасць:

ніжняя мяжа выяўлення: ≤ 0,001 пг/мкл (для UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01 pg/мкл (для 5-OMe-UTP-dsRNA).

ніжняя мяжа колькаснага вызначэння: 0,0156 пг/мкл (для UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 пг/мкл (для N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 пг/мкл (для 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Дакладнасць: CV ўнутранага аналізу ≤10%, CV інтэр-аналізу ≤10%

3. Аднаўленне: 80%~120%

4. Лінейнасць: 0,0156-0,5 пг/мкл (для UTP-, pUTP-dsRNA) 0,0312-1 pg/мкл (для дсРНК N1-Me-pUTP), 0,0625-1 пг/мкл (для 5-OMe-UTP-dsRNA).

Меркаванні

1. Тэмпература і час рэакцыі TMB маюць вырашальнае значэнне, калі ласка, кантралюйце іх у строгай адпаведнасці з інструкцыямі.

2. Каб дасягнуць добрай узнаўляльнасці аналізу і адчувальнасці, вельмі важна належнае прамыванне пласцін для выдалення лішкаў рэагентаў, якія не прарэагавалі.

3. Усе рэагенты трэба старанна змяшаць перад выкарыстаннем і пазбягаць камянёў падчас дадання ўзору або рэагентаў.

4. Калі ў канцэнтраваным прамыўным буферы (20x) утварыліся крышталі, нагрэйце яго да 37 ℃ і акуратна змяшайце, пакуль крышталі цалкам не растворацца.

5. Пазбягайце аналізу ўзораў, якія змяшчаюць азід натрыю (NaN3), бо ён можа разбурыць актыўнасць HRP, што прывядзе да заніжэння колькасці дцРНК.

6. Пазбягайце заражэння РНКазой падчас аналізу.

7. Стандарт/узор, антыцелы для выяўлення і SA-HRP таксама можна правесці пры КТ без устрэсвання, але гэта можа прывесці да зніжэння адчувальнасці выяўлення ў адзін раз.У гэтым выпадку мы рэкамендуем стандарты дсРНК UTP і pUTP разводзіць з 2 пг/мкл, стандарты дсРНК N1-Me-pUTP трэба разводзіць з 4 пг/мкл, а стандарт дсРНК 5-OMe-UTP трэба разводзіць з 8 пг/мкл.Акрамя таго, інкубуйце працоўны раствор HRP-стрэптавідыну на працягу 60 хвілін пры пакаёвай тэмпературы.Не выкарыстоўвайце шейкер, таму што шейкер можа прывесці да недакладных вынікаў.

Тыповы вынік

1. Стандартныя дадзеныя крывой

2. Разлік стандартнай крывой

3. Дыяпазон выяўлення лайнера: 0,0312-1 пг/мкл