мРНК Cap2'-O-Methyltransferase

мРНК Cap 2´-O-метилтрансфераза была атрымана з рэкамбінантнага штаму E. coli, які нясе ген мРНК Cap 2'-O-метилтрансферазы вакцыны.Гэты фермент дадае метыльную групу ў становішчы 2´-O першага нуклеатыду побач са структурай кэпа на 5'-канцы РНК. Фермент выкарыстоўвае S-адэназілметыёнін (SAM) у якасці донара метыла для РНК, закрытай метылам (кэп -0), што прыводзіць да структуры cap- 1.

Структура Cap1 можа павялічыць эфектыўнасць трансляцыі, паляпшаючы экспрэсію мРНК у эксперыментах з трансфекцыяй і мікраін'екцыямі. Для гэтага фермента ў якасці субстрата патрабуецца РНК з кэпам m7GpppN.Ён не можа выкарыстоўваць РНК з pN, ppN, pppN або GpppN на 5' канцы.Кэпіраваная РНК можа быць атрымана з дапамогай транскрыпцыі in vitro з выкарыстаннем аналага кэпа або праз ферментатыўнае кэпаванне з выкарыстаннем фермента для кэпіравання вакцыніі.

Кампаненты

мРНК Cap 2´-O-метилтрансфераза (50U/мкл)

10 × Буфер рэакцыі закрыцця

Захоўванне

-25 ～- 15 ℃ для захоўвання （ Пазбягайце паўторных цыклаў замарожвання-адтавання）

Буфер для захоўвання

20 мм Tris-HCl (pH 8,0, 25°C), 100 мм NaCl, 1 мм DTT, 0,1 мм ЭДТА, 0,1% Triton X-100, 50% гліцэрыны.

Вызначэнне адзінкі

Адна адзінка вызначаецца як колькасць фермента, неабходнага для метилирования 10 пмолей транскрыпту РНК даўжынёй 80 нт за 1 гадзіну пры 37°C.

Аналізы кантролю якасці

Экзануклеаза:50U мРНК Cap 2 ´ -O-Methyltransferase з 1 мкг λ-Hind III расшчапляюць ДНК пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін, што не прыводзіць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.

Эндануклеаза: 50 ЕД мРНК Cap 2 ´ -O-Метылтрансферазы з 1 мкг λДНК пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін не прыводзяць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.

Нікасэ: 50 ЕД мРНК Cap 2´ -O-Метылтрансферазы з 1 мкг pBR322 пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін не прыводзяць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.

РНКаза: 50U мРНК Cap 2´ -O-Methyltransferase з 1,6 мкг MS2 РНК на працягу 4 гадзін пры 37 ℃ не прыводзіць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.

E. палачка ДНК: 50 ЕД мРНК Cap 2 ´ -O-метилтрансферазы правяраецца на наяўнасцьE. палачка геномнай ДНК з выкарыстаннем TaqMan qPCR з праймерамі, спецыфічнымі дляE. палачка Локус 16S рРНК.TheE. палачка кантамінацыя геномнай ДНК =1E. палачка геном.

Бактэрыяльны Эндатаксін: LAL-тэст, у адпаведнасці з Кітайскай фармакапеяй IV 2020 г., метад тэставання ліміту геля, агульнае правіла (1143).Змест бактэрыяльнага эндатаксіны павінна складаць =10 ЕС/мг.

Сістэма і ўмовы рэакцыі

1. Змяшайце адпаведную колькасць закрытай РНК і H2O без РНКазы ў 1,5 мл прабірцы для мікрацэнтрыжавання да канчатковага аб'ёму 16,0 мкл.

2. Награвайце пры тэмпературы 65 ℃ на працягу 5 хвілін, затым пастаўце ў ванну з лёдам на працягу 5 хвілін.

3. Дадайце наступныя кампаненты ў пазначаным парадку (для метилирования Кэппированной РНК

менш за 10

*10× Буфер для рэакцыі закрыцця: 500 мм Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 мм KCl, 10 мм MgCl2, 10 мм DTT.

4. Інкубуйце пры 37 ℃ на працягу 1 гадзіны (рэкамендуецца 2 гадзіны інкубацыі для мэтавага фрагмента менш за 200 нт).

Прыкладанні

Для паляпшэння экспрэсіі мРНК падчас эксперыментаў па мікраін'екцыі і трансфекцыі.

Заўвагі па выкарыстанні

1. Перад рэакцыяй РНК неабходна ачысціць і растварыць у вадзе без нуклеаз, усе растворы не павінны ўтрымліваць ЭДТА і іёны.

2. Рэкамендуецца награваць узор РНК пры 65 ℃ на працягу 5 хвілін перад рэакцыяй, каб выдаліць другасную структуру на 5'-канцы стэнаграмы.Гэта можа быць падоўжана да 10 хвілін для складанай 5'-канцавой структуры.