PNGase Ф
Пептыд-N-гліказідаза F (PNGase F) з'яўляецца найбольш эфектыўным ферментатыўным метадам для выдалення амаль усіх N-звязаных алігацукрыдаў з глікапратэінаў.PNGase F - гэта амідаза, якая расшчапляе ўнутраныя рэшткі GlcNAc і аспарагіну гібрыдных і складаных алігацукрыдаў з высокім утрыманнем манозы ад N-звязаных глікапратэінаў.
Ужыванне
Гэты фермент карысны для выдалення рэшткаў вугляводаў з бялкоў.
Падрыхтоўка і спецыфікацыя
| Знешні выгляд | Бескаляровая вадкасць |
| Чысціня бялку | ≥95% (са SDS-PAGE) |
| актыўнасць | ≥500 000 ЕД/мл |
| Экзогликозидаза | Ніякіх дзеянняў не выяўлена (ND) |
| Эндогликозидаза F1 | ND |
| Эндогликозидаза F2 | ND |
| Эндогликозидаза F3 | ND |
| Эндагліказідаза Н | ND |
| Пратэаза | ND |
Уласцівасці
| Нумар EC | 3.5.1.52(Рэкамбінант з мікраарганізма) |
| Малекулярная маса | 35 кДа (SDS-PAGE) |
| Ізаэлектрычная кропка | 8. 14 |
| Аптымальны pH | 7,0-8,0 |
| Аптымальная тэмпература | 65 °C |
| Субстратная спецыфіка | Расшчапленне гліказідных сувязей паміж GlcNAc і рэшткамі аспарагіну Мал.1 |
| Сайты прызнання | N-звязаныя гліканы, калі яны не ўтрымліваюць α1-3 фукозу (мал. 2). |
| Актыватары | DTT |
| Інгібітар | SDS |
| Тэмпература захоўвання | -25 ~ -15 ℃ |
| Цеплавая інактывацыі | 20 мкл рэакцыйнай сумесі, якая змяшчае 1 мкл PNGase F, інактывуюць шляхам інкубацыі пры 75 °C на працягу 10 хвілін. |
Мал. 1 Субстратная спецыфічнасць PNGase F
Мал. 2 Месцы распазнавання PNGase F.
Калі ўнутраныя рэшткі GlcNAc звязаны з α1-3 фукозай, PNGase F не можа адшчапіць N-звязаныя алігацукрыды ад глікапратэінаў.Гэтая мадыфікацыя часта сустракаецца ў глікапратэінах раслін і некаторых насякомых.
Cкампаненты
|
| Кампаненты | Канцэнтрацыя |
| 1 | PNGase Ф | 50 мкл |
| 2 | 10 × Буфер для дэнатурацыі глікапратэіну | 1000 мкл |
| 3 | 10 × GlycoBuffer 2 | 1000 мкл |
| 4 | 10% НП-40 | 1000 мкл |
Вызначэнне адзінкі
Адна адзінка (U) вызначаецца як колькасць фермента, неабходнага для выдалення >95% вугляводаў з 10 мкг дэнатураванай РНКазы B за 1 гадзіну пры 37°C у агульным рэакцыйным аб'ёме 10 мкл.
Умовы рэакцыі
1. Растворыце 1-20 мкг глікапратэіну ў дэіянізаванай вадзе, дадайце 1 мкл 10× буфера для дэнатурацыі глікапратэіну і H2O (пры неабходнасці), каб атрымаць агульны аб'ём рэакцыі 10 мкл.
2.Інкубуйце пры 100°C 10 хвілін, астудзіце на лёдзе.
3.Дадайце 2 мкл 10×GlycoBuffer 2, 2 мкл 10% NP-40 і змяшайце.
4.Дадайце 1-2 мкл PNGase F і H2O (пры неабходнасці), каб агульны аб'ём рэакцыі склаў 20 мкл, і змяшайце.
5.Інкубуйце рэакцыю пры 37 ° C на працягу 60 хвілін.
6.Для аналізу SDS-PAGE або аналізу HPLC.
