Фермент, які закрывае вірус вакцыны

Кэпінг-фермент віруса вакцыніі атрыманы з рэкамбінантнага штаму кішачнай палачкі, які нясе гены кэпінг-фермента кепкі.Гэты адзіны фермент складаецца з дзвюх субадзінак (D1 і D12) і мае тры ферментатыўныя актыўнасці (РНК-трыфасфатаза і гуанілілтрансфераза субадзінак D1 і гуанін-метилтрансфераза субадзінак D12).Фермент кепкі віруса вакцыны эфектыўны для каталізацыі фарміравання кэп-структуры, якая можа спецыяльна прымацоўваць кэп-структуру 7-метылгуанілата (m7Gppp, Cap 0) да 5'-канца РНК.Структура кэпа (Cap 0) гуляе важную ролю ў стабілізацыі, транспарце і трансляцыі мРНК у эўкарыёт.Кэпінг РНК з дапамогай ферментатыўнай рэакцыі - гэта эфектыўны і просты метад, які можа значна палепшыць стабільнасць і трансляцыю РНК для транскрыпцыі, трансфекцыі і мікраін'екцыі in vitro.

Кампаненты

Фермент, які кіруе вірусам вакцыны (10 ЕД/мкл)

10 × буфер для закрыцця

Умовы захоўвання

-25～- 15℃ для захоўвання （ Пазбягайце паўторных цыклаў замарожвання-адтавання）

Буфер для захоўвання

20 мм Tris-HCl (pH 8,0), 100 мм NaCl,

1мМ ДТТ, 0,1мМ ЭДТА, 0,1% Трытон X-100, 50% гліцэрына.

Вызначэнне адзінкі

Адна адзінка капінг-фермента віруса вакцыны вызначаецца як колькасць фермента, неабходнага для ўключэння 10 пмоль ГТФ у 80-ты стэнаграму за 1 гадзіну пры 37°C.

Кантроль якасці

Экзануклеаза:10 ЕД фермента, які кіруе вірусам вакцыны, з 1 мкг λ-Hind III расшчапляюць ДНК пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін, што вызначана электрафарэзам у агарозным гелі, не прыводзіць да дэградацыі.

Эндануклеаза:10 ЕД фермента, які закрывае вірус вакцыны, з 1 мкг λДНК пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін не прыводзяць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.

Nickase:10 ЕД фермента, які закрывае вірус вакцыны, з 1 мкг pBR322 пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін не прыводзяць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.

РНКаза:10 ЕД фермента, які закрывае вірус вакцыны, з 1,6 мкг РНК MS2 на працягу 4 гадзін пры 37 ℃ не прыводзяць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.

1.ДНК coli:10 ЕД фермента капінгавання віруса вакцыніі правяраецца на наяўнасць геномнай ДНК E. coli з дапамогай кПЦР TaqMan з праймерамі, спецыфічнымі для локуса 16S рРНК E. coli.Забруджванне геномнай ДНК E. coli складае ≤1 генома E. coli.

2.Бактэрыяльны Эндатаксін: LAL-тэст, у адпаведнасці з Кітайскай фармакапеяй IV 2020 г., метад тэставання ліміту геля, агульнае правіла (1143).Змест бактэрыяльнага эндатаксіну павінна быць ≤10 EU/мг.

Сістэма і ўмовы рэакцыі

1. Пратакол закрыцця (рэакцыйны аб'ём: 20 мкл)

Гэтая працэдура дастасавальная да рэакцыі каўпачэння 10 мкг РНК (≥100 нт) і можа быць павялічана ў адпаведнасці з эксперыментальнымі патрабаваннямі.

I) Змяшайце 10 мкг РНК і H2O без нуклеазы ў 1,5 мл прабірцы для мікрацэнтрыжавання да канчатковага аб'ёму 15,0 мкл.*10 × Буфер для закрыцця: 0,5 М Трыс-HCl, 50 мм KCl, 10 мм MgCl2, 10 мм DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Награвайце пры 65 ℃ на працягу 5 хвілін, а затым на ледзяной лазні на працягу 5 хвілін.

3) Дадайце наступныя кампаненты ў пазначаным парадку

*10 × Буфер для закрыцця: 0,5 М Трыс-HCl, 50 мм KCl, 10 мм MgCl2, 10 мм DTT, (25 ℃, pH8,0)

4) Інкубуйце пры 37°C на працягу 30 хвілін, цяпер РНК закрыта і гатовая да наступнага прымянення.

2. 5′ тэрмінал рэакцыя маркіроўкі (аб'ём рэакцыі: 20 мкл)

Гэты пратакол прызначаны для маркіроўкі РНК, якая змяшчае 5´ трыфасфат, і яго можна павялічыць у адпаведнасці з патрабаваннямі.На эфектыўнасць уключэння меткі будзе ўплываць малярнае суадносіны РНК: ГТФ, а таксама ўтрыманне ГТФ ва ўзорах РНК.

1) Злучыце адпаведную колькасць РНК і H2O без нуклеазы ў 1,5 мл прабірцы для мікрацэнтрыжавання да канчатковага аб'ёму 14,0 мкл.

2) Награвайце пры 65 ℃ на працягу 5 хвілін, а затым на ледзяной лазні на працягу 5 хвілін.

3) Дадайце наступныя кампаненты ў пазначаным парадку.

** GTP MIX адносіцца да GTP і невялікай колькасці маркераў.Каб даведацца пра канцэнтрацыю GTP, глда заўвагі 3.

4) Інкубуйце пры 37°C на працягу 30 хвілін, канец 5' РНК цяпер пазначаны і гатовы да далейшага патоку

Прыкладанні

1. Кэпінг мРНК перад аналізамі трансляцыі/трансляцыі in vitro

2. Маркіроўка 5'-канца мРНК

Заўвагі па выкарыстанні

1.Награванне раствора РНК перад інкубацыяй з ферментам кэпінгу вакцыны выдаляе другасную структуру на 5'-канцы стэнаграмы.Павялічце час да 60 хвілін для расшыфровак з вядомымі высокаструктураванымі 5-канцамі.

2. РНК, якая выкарыстоўваецца для рэакцый капіравання, павінна быць ачышчана перад выкарыстаннем і суспендирована ў вадзе без нуклеаз.ЭДТА не павінна прысутнічаць, а раствор не павінен утрымліваць солі.

3. Для маркіроўкі 5'-канца агульная канцэнтрацыя GTP павінна быць прыкладна ў 1-3 разы большай за малярную канцэнтрацыю мРНК у рэакцыі.

4. Аб'ём рэакцыйнай сістэмы можа быць павялічаны або паменшаны ў адпаведнасці з фактычным.