5×Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Кат. №: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) - гэта высокастабільная сумесь на аснове зонда з адной прабіркі, прыдатная для аднаэтапнай зваротнай транскрыпцыі і колькаснай ПЦР (qRT-PCR).Ён падтрымлівае папярэдняе змешванне праймераў і зондаў і застаецца стабільным пасля працяглага захоўвання пры нізкай тэмпературы.Узор для тэсціравання можа быць дададзены непасрэдна пры выкарыстанні без дадатковага адкрыцця прабіркі/аперацыі піпетавання.Гэты прадукт змяшчае кампаненты, напрыклад ДНК-палімеразу гарачага старту, M-MLV, тэрмаўстойлівую урацылавую ДНК-гліказілазу (TS-UNG), інгібітар РНКазы, MgCl2, dNTP (з dUTP замест dTTP) і стабілізатары.З генетычна мадыфікаванай хуткай ампліфікацыяй зваротнай транскрыптазы і ДНК-палімеразы можна завяршыць ПЦР-ампліфікацыю на працягу 20-40 хвілін.У гэтым рэагенце выкарыстоўваецца спецыяльны буфер для кПЦР са змешанымі ферментамі з антыінгібітарнага фермента ампліфікацыі і фермента UNG.Такім чынам, ён можа атрымаць добрую ампліфікацыю генаў-мішэняў і прадухіліць ілжывую ампліфікацыю, выкліканую рэшткавым ПЦР і аэразольным забруджваннем.Гэты рэагент сумяшчальны з большасцю флуарэсцэнтных колькасных прыбораў для ПЦР ад такіх вытворцаў, як Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad і Roche.
Кампанент
1.25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix
2.Буфер папярэдняга змешвання 5×Neoscript Fast RT (dUTP)
Умовы захоўвання
Усе кампаненты павінны захоўвацца пры -20 ℃ для працяглага захоўвання і 4 ℃ да 3 месяцаў.Калі ласка, старанна змяшайце пасля адтавання і цэнтрыфугу перад выкарыстаннем.Пазбягайце частага замарожвання-адтавання.
Падрыхтоўка рэакцыйнай сістэмы qRT-PCR
| Кампаненты | 25мклсістэма | 50мклсістэма | Канчатковая канцэнтрацыя |
| Буфер папярэдняга змешвання 5×Neoscript Fast RT (dUTP) | 5 мкл | 10 мкл | 1× |
| 25×Neoscript Fast RTase/UNG Mix | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| 25× Сумесь грунтоўкі і зондаa | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Матрычная РНКb | – | – | – |
| ddH2O | Да 25 мкл | Да 50 мкл | – |
1) а. Канчатковая канцэнтрацыя праймера звычайна складае 0,2 мкМ.Для дасягнення лепшых вынікаў канцэнтрацыю праймера можна аптымізаваць у дыяпазоне 0,2-1 мкМ.Як правіла, канцэнтрацыю зонда можна аптымізаваць у дыяпазоне 0,1-0,3 мкМ.
2) b. Пры выкарыстанні хуткай працэдуры ПЦР павышэнне канцэнтрацыі праймераў і зондаў можа прывесці да лепшых вынікаў ампліфікацыі, і іх суадносіны павінны быць адпаведна аптымізаваны.
3) Розныя тыпы ўзораў утрымліваюць розныя тыпы і ўтрыманне інгібітараў і колькасць копій гена-мішэні.Аб'ём выбаркі павінен разглядацца ў адпаведнасці з фактычным станам.Пры неабходнасці развядзіце ўзор вадой без нуклеазы або буферам TE.
Рэакцыя Сумовах
| Звычайная працэдура ПЦР | Хуткая працэдура ПЦР | ||||||
| Працэдура | тэмп. | Час | Цыкл | Працэдура | тэмп. | Час | Цыкл |
| Зваротная транскрыпцыя | 50 ℃ | 10-20 хвілін | 1 | Зваротная транскрыпцыя | 50 ℃ | 5 хвілін | 1 |
| Палімераза Актывацыя | 95 ℃ | 1-5 хвілін | 1 | Палімераза Актывацыя | 95 ℃ | 30-я гады | 1 |
| Дэнатурацыя | 95 ℃ | 10-20-я гады | 40-50 | Дэнатурацыя | 95 ℃ | 1-3с | 40-50 |
| Адпал і Пашырэнне | 56-64 ℃ | 20-60-я гады | Адпал і Пашырэнне | 56-64 ℃ | 3-20-я гады | ||
Кантроль якасці
1.Выяўленне функцый: адчувальнасць, спецыфічнасць і паўтаральнасць КПЦР.
2.Няма актыўнасці экзагеннай нуклеазы: няма забруджвання экзагеннай эндануклеазай і экзануклеазай.
Заўвагі
1.Хуткасць ампліфікацыі хуткай ДНК-палімеразы складае не менш за 1kb/10s.Розныя прыборы для ПЦР маюць розныя хуткасці нагрэву і астуджэння, рэжымы кантролю тэмпературы і цеплаправоднасць, і, такім чынам, аптымізацыя канцэнтрацыі праймера/зонда і метаду працы ў спалучэнні з вашым канкрэтным прыборам хуткай ПЦР вельмі важная.
2.Гэты прадукт мае шырокае прымяненне і падыходзіць для высокаадчувальнай малекулярнай дыягностыкі.Трохэтапны метад ПЦР рэкамендуецца для праймеров з нізкай тэмпературай адпалу або для ампліфікацыі доўгіх фрагментаў больш за 200 п.н.
3.Паколькі розныя ампліконы маюць розную эфектыўнасць выкарыстання dUTP і розную адчувальнасць да UNG, рэагенты павінны быць аптымізаваны, калі адчувальнасць выяўлення зніжаецца пры выкарыстанні сістэмы UNG.Пры неабходнасці звяжыцеся з намі для атрымання тэхнічнай падтрымкі.
4.Каб пазбегнуць ампліфікацыі перанесеных прадуктаў ПЦР, для ампліфікацыі патрабуецца спецыяльная эксперыментальная зона і піпетка.Працуйце ў пальчатках, часта мяняйце іх і не адкрывайце прабірку для ПЦР пасля ампліфікацыі.
