Міні-набор для экстракцыі ДНК
У гэтым наборы выкарыстоўваецца аптымізаваная буферная сістэма і тэхналогія ачысткі ў калонцы з сілікагелем, якая можа аднаўляць фрагменты ДНК памерам 70 пн – 20 кб з розных канцэнтрацый ТАЭ або ТБЭ агарознага геля.Калонка для адсорбцыі ДНК можа спецыяльна адсарбаваць ДНК ва ўмовах высокага ўтрымання солі.Акрамя таго, набор можа непасрэдна ачышчаць фрагменты ДНК з прадуктаў ПЦР, ферментатыўных рэакцыйных сістэм або сырых прадуктаў ДНК, атрыманых іншымі метадамі, і выдаляць прымешкі, такія як вавёркі, іншыя арганічныя злучэнні, іёны неарганічных соляў і алігануклеатыдныя праймеры.Гэта можа гарантаваць, што ачыстка можа быць завершана на працягу 10-15 хвілін.Вычышчаная ДНК можа выкарыстоўвацца непасрэдна для перавязкі, трансфармацыі, расшчаплення ферментаў, транскрыпцыі in vitro, ПЦР, секвенирования, мікраін'екцый і г.д.
Умовы захоўвання
Захоўваць пры -15 ~ -25 ℃ і транспартаваць пры пакаёвай тэмпературы.
Кампаненты
| Кампаненты | (100 rxns) |
| Буферны ВУП | 80 мл |
| Буфер GW | 2 × 20 мл |
| Буфер для элюцыі | 20 мл |
| Міні-калонкі FastPure DNA-G | 100 |
Буферны ВУП:Буфер звязвання ДНК.
Буфер GW:Промывной буфер;перад выкарыстаннем дадаць абсалютны этанол у аб'ёме, пазначаным на бутэльцы.
Буфер для элюіравання:Элюцыя.
Міні-калонкі FastPure DNA-G:ДНК-адсарбцыйныя калонкі.
Прабіркі для збору 2 мл:Прабіркі для збору фільтрата.
Падрыхтаваныя матэрыялы
Стэрылізаваныя прабіркі аб'ёмам 1,5 мл, абсалютны этанол і ізапрапанол (калі фрагмент ДНК ≤100 п.о., дадайце 1 аб'ём
ізапрапанолу на 1 аб'ём геля), вадзяная лазня.
Працэс эксперыменту
Перад выкарыстаннем дадайце 80 мл этанолу ў буфер GW, як паказана на этыкетцы, захоўвайце пры пакаёвай тэмпературы.
Механізм
1. Раствор рэакцыі ПЦР
Схема гелевай экстракцыі: дадайце роўны аб'ём буфера GDP ПЦР рэакцыйная схема аднаўлення раствора:Дадайце 5-кратны аб'ём буфера
2. ВУП Разлічыце аб'ём геля (100 μl роўна 100 мг)
Растварыць гель
3. Разагрэйце пры 50 ~ 55℃
4. Звязаць Мыццё
Дадайце 300 мкл буфера GDP*
Дадайце 700 мкл буфера GW
Дадайце 700 мкл буфера GW
5. Элюіруйце
Дадайце 20-30 мкл буфера для элюцыі або дэіянізаванай вады
Заўвагі* Аднаўленне рэакцыйнай вадкасці ПЦР без гэтага кроку
Праграму для экстракцыі геля
1. Пасля электрафарэзу ДНК для фракцыянавання фрагментаў ДНК выражыце адну палоску фрагмента ДНК з агарознага геля пад УФ-святлом.Рэкамендуецца выкарыстоўваць паглынальную паперу, каб паглынуць відавочную вільгаць геля і мінімізаваць памер зрэзу геля, выдаліўшы лішнюю агарозу, наколькі гэта магчыма.Узважце зрэз геля (без мікрацэнтрыфужнай прабіркі), каб вылічыць яго аб'ём: аб'ём зрэзу геля ў 100 мг роўны прыблізна 100 мкл, пры ўмове, што шчыльнасць роўная 1 г/мл.
2. Дадайце роўны аб'ём буфера GDP, інкубуйце пры 50~55 ℃ на працягу 7-10 хвілін (у залежнасці ад памеру геля адрэгулюйце час інкубацыі да поўнага растварэння геля).Перагортвайце прабірку 2 разы падчас інкубацыі.
Δ Даданне 1-3 аб'ёмаў буфера GDP не паўплывае на эфектыўнасць аднаўлення ДНК.Калі фрагмент ДНК, які трэба аднавіць, <100 п.н., трэба дадаць 3 аб'ёмы буфера GDP;калі зрэз геля цалкам растворыцца, дадайце 1 аб'ём ізапрапанолу і старанна змяшайце, затым перайдзіце да наступнага кроку.
3. Ненадоўга адцэнтрыфугуйце, каб узор апусціўся на дно прабіркі, устаўце міні-калонкі FastPure DNA Columns-G у прабіркі для збору 2 мл, асцярожна перанясіце раствор максімум 700 мкл адзін раз у
час да фільтрацыйных калонак, цэнтрыфуга пры 12 000 аб / мін (13 800 X g) 30-60 сек.
4. Выліце фільтрат і дадайце ў калонку 300 мкл буфера GDP, інкубуйце пры пакаёвай тэмпературы на працягу 1 хвіліны, цэнтрыфугуйце пры 12 000 абаротаў у хвіліну (13 800 X g) на працягу 30-60 секунд.
5. Выліце фільтрат і дадайце 700 мкл буфера GW (праверце, ці быў дададзены абсалютны этанол загадзя!) у калонку, цэнтрыфугуйце пры 12 000 абаротаў у хвіліну (13 800 X g) на працягу 30-60 секунд.
Δ Калі ласка, дадайце буфер GW вакол сценкі адсарбцыйнай калонкі або дадайце заднюю крышку буфера GW і змяшайце яго ўверх дном 2-3 разы, каб цалкам змыць соль, якая прыстала да сценкі трубкі.
6. Паўтарыце крок 5.
Δ Двойчы прамыванне буферам GW можа гарантаваць поўнае выдаленне солі і ліквідаваць уплыў на наступныя эксперыменты.
7. Выкіньце фільтрат і центрифугируйте пустую калонку пры 12 000 абаротаў у хвіліну (13 800 X g) на працягу 2 хвілін.
8. Устаўце калонку ў чыстую мікрацэнтрыфужную прабірку на 1,5 мл, дадайце 20 - 30 мкл буфера для элюцыі ў цэнтр мембраны калонкі, інкубуйце 2 хвіліны, а затым цэнтрыфугуйце пры 12000 абаротаў у хвіліну (13800 X g) на працягу 1 хвіліны.Выкіньце калонку, захавайце атрыманую ДНК пры -20 .
Δ Перанос супернатанту этапу 8 у калонку для паўторнага элюіравання і папярэдні нагрэў элюцыйнага буфера да 55 (калі фрагмент ДНК >3 кб) можа быць карысным для павышэння эфектыўнасці аднаўлення.
Праграму для аднаўлення прадуктаў пцр
Гэты пратакол прымяняецца для ачысткі фрагментаў ДНК ад прадуктаў ПЦР, сістэмы ферментатыўнай рэакцыі і іншых неапрацаваных прадуктаў ДНК (уключаючы генетычную ДНК).Гэты раствор можа эфектыўна выдаляць розныя нуклеатыды, праймеры, дымеры праймераў, малекулы солі, ферменты і іншыя прымешкі.
1. Каротка адцэнтрыфугуйце прадукты ПЦР, раствор ферментатыўнай рэакцыі і іншыя неачышчаныя прадукты ДНК.Піпеткай ацэньваюць іх аб'ём і пераносяць у стэрылізаваныя прабіркі аб'ёмам 1,5 мл або 2 мл.Дадаць ddH2O да аб'ёму 100 мкл;у той час як для геномнай ДНК з высокай канцэнтрацыяй развядзенне да 300 мкл ddH2O дапаможа палепшыць эфектыўнасць аднаўлення.
2. Дадайце 5 аб'ёмаў буфера GDP, старанна змяшайце, пераварочваючы або варочаючы.Калі фрагмент ДНК, які цікавіць, >100 п.н., трэба дадаць дадатковыя 1,5 аб'ёму (узоры + буфер GDP) этанолу.
3. Устаўце калонку назад у зборную прабірку, перанясіце сумесь у калонку, цэнтрыфугуйце пры 12 000 абаротаў у хвіліну (13 800 ×g) на працягу 30-60 секунд.Калі аб'ём змешанага раствора >700 мкл, пастаўце адсарбцыйную калонку назад у зборную прабірку, перанясіце пакінуты раствор у адсарбцыйную калонку і цэнтрыфугуйце пры 12 000 абаротаў у хвіліну (13 800 × g) на працягу 30-60 секунд.
4. Наступнае выкананне адносіцца да крокаў 5 - 8 праграмы 08-1/Гелевая экстракцыя.
Прыкладанні
Розныя канцэнтрацыі TAE або TBE агарозного геля;ПЦР-прадукты, ферментатыўныя рэакцыйныя сістэмы або іншыя сырыя прадукты ДНК, атрыманыя рознымі метадамі.Адноўленыя фрагменты вар'іраваліся ад70 bp -20 kb.
Заўвагі
Толькі для даследчага выкарыстання.Не для выкарыстання ў дыягнастычных працэдурах.
1. Перад выкарыстаннем дадайце 80 мл этанолу ў разбаўлены буфер GW, як паказана на этыкетцы, захоўвайце пры пакаёвай тэмпературы.
2. Калі буфер GDP лёгка выпадае ў асадак падчас нізкатэмпературнага захоўвання, яго можна паставіць пры пакаёвай тэмпературы на некаторы час перад выкарыстаннем.Пры неабходнасці яго можна папярэдне нагрэць на вадзяной лазні пры тэмпературы 37 ℃ да поўнага растварэння асадка, а затым выкарыстоўваць пасля змешвання.
3. Загадзя ўсталюйце тэмпературу вадзяной лазні на 50 ~55 ℃.
4. На этапе 1 праграмы 08-1/экстракцыі геля мінімізацыя памеру кавалачка геля значна скароціць час растварэння і павысіць эфектыўнасць аднаўлення (лінеарызаваная ДНК лёгка гідралізуецца пры пастаянным уздзеянні высокай тэмпературы).Не падвяргайце гель ДНК уздзеянню ультрафіялету на працягу доўгага часу, так як ультрафіялетавае святло можа выклікаць пашкоджанне ДНК.
5. Цалкам растварыце гель у 08-1/крок 2 праграмы экстракцыі геля, у адваротным выпадку эфектыўнасць аднаўлення ДНК будзе сур'ёзна парушана.
6. Разагрэйце буфер для элюіравання або ddH2O да 55 ℃, што дапамагае палепшыць эфектыўнасць элюіравання ДНК.Рэкамендуецца захоўваць ДНК у элюенце 2,5 мМ трис-HCl, pH 7,0 - 8,5.
