EndoFree Plasmid Maxi Kit
Гэты набор падыходзіць для экстракцыі з 150-300 мл бактэрыяльнага раствора, культываванага на працягу ночы, з выкарыстаннем палепшанага метаду SDS-шчолачнага лізісу для лізісу бактэрый.Неачышчаны экстракт выбарачна аб'ядноўваецца з унікальным эндатаксінам і аддзяляецца цэнтрыфугаваннем для выдалення эндатаксінаў.Затым мембрана силикагеля селектыўна звязваецца з плазмидной ДНК у растворы ва ўмовах высокага ўтрымання солі і нізкага pH.Пасля гэтага дадаецца прамыўны буфер для выдалення прымешак і іншых бактэрыяльных кампанентаў.Нарэшце, элююючы буфер з нізкім утрыманнем солі і высокім рН выкарыстоўваецца для элюіравання чыстай плазміднай ДНК з крэмніевай матрычнай мембраны.У силикагелевой мембране выкарыстоўваецца спецыяльная адсарбцыйная мембрана, і розніца ў колькасці адсорбцыі паміж калонкай і калонкай вельмі малая, а паўтаральнасць добрая.Фенол, хлараформ і іншыя таксічныя рэагенты не патрабуюцца, а таксама этапы асаджэння этанолам.Гэты набор можа быць выкарыстаны для хуткай экстракцыі 0,2-1,5 мг чыстай плазміднай ДНК з высокім капіраваннем з хуткасцю экстракцыі 80%-90%.У наборы выкарыстоўваецца унікальная формула працэсу выдалення эндатаксіну, утрыманне эндатаксіну надзвычай нізкае, а эфект трансфекцыі клетак выдатны.Вынятая плазміда можа быць непасрэдна выкарыстана ў ферментным расшчапленні, ПЦР, транскрыпцыі in vitro, трансфармацыі, секвенировании і іншых эксперыментах па малекулярнай біялогіі.
Умовы захоўвання
РНКазу трэба захоўваць пры -30 ~ -15 ℃ і транспартаваць пры ≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger можна захоўваць пры тэмпературы 2 ~ 8 ℃ на працягу аднаго месяца, захоўваць пры -30 ~ -15 ℃ для працяглага захоўванняі транспартуецца пры ≤0℃.
Іншыя кампаненты павінны захоўвацца пры пакаёвай тэмпературы (15 ~25 ℃) і транспартавацца пры пакаёвай тэмпературы.
Кампаненты
| Кампаненты | 10RXNS |
| РНКаза А | 750 мкл |
| Буфер P1 | 75 мл |
| Буфер P2 | 75 мл |
| Буфер P4 | 75 мл |
| Паглынальнік эндатаксінаў | 25 мл |
| Буфер PW | 2 × 22 мл |
| Буферны сухоты | 20 мл |
| Калонкі FastPure DNA Maxi (кожная ў прабірцы для збору па 50 мл) | 10 |
| Прабірка для збору без эндатаксінаў | 2 × 5 |
РНКаза:10 мг/мл, выкарыстоўваецца для выдалення РНК.
Буфер P1:буфер для бактэрыяльнай завісі, дадайце РНКазу ў буфер P1 перад першым выкарыстаннем.
Буфер P2:буфер для лізісу бактэрый (які змяшчае SDS/NaOH).
Буфер P4:нейтралізуе буфер.
Паглынальнік эндатаксінаў:эфектыўна выдаляюць эндатаксіны з сырога экстракта плазміды.
Буфер PW:буфер для прамывання, дадайце прадугледжаны аб'ём этанолу перад першым выкарыстаннем.
Буферны ТБ:элюционный буфер.
Калонкі FastPure DNA Maxi:адсорбцыйныя калонкі плазмидной ДНК.
Прабіркі для збору 50 мл:трубкі для збору фільтрата.
Прабірка для збору без эндатаксінаў:прабіркі для збору плазмидной ДНК.
Падрыхтаваныя матэрыялы
Абсалютны этанол, ізапрапанол, 50 мл цэнтрыфужных прабірак з круглым дном і 50 мл без эндатаксінаўцэнтрыфужныя прабіркі.
Прыкладанні
Гэты прадукт падыходзіць для буйнамаштабнай экстракцыі плазмід з 150 - 300 мл бактэрыяльнага растворакультываваць за ноч.
Працэс эксперыменту
1. Вазьміце 150 – 200 мл (не больш за 300 мл) бактэрыяльнага раствора, пасеянага на ноч, і адцэнтрыфугуйце прыкаля 11 000 абаротаў у хвіліну (12 000 × g) на працягу 1 - 2 хвілін.Выкіньце супернатант і збярыце бактэрыі.
Δ Пры зборы больш за 50 мл бактэрыяльнага раствора бактэрыі можна сабраць шляхам дадання бактэрыяльнага раствора, цэнтрыфугавання, адкідвання супернатанту і іншых этапаў у тую ж прабірку на 50 мл для
некалькі разоў.
2. Дадайце 7,5 мл буфера P1 (калі ласка, праверце, ці была дададзена ў буфер P1 РНКаза) у цэнтрыфугупрабірку, якая змяшчае бактэрыі, і старанна змяшайце з дапамогай вортэкса або піпеткі.
Δ Поўная ресуспендирование бактэрый на гэтым этапе мае вырашальнае значэнне для атрымання ўраджаю, і пасля ресуспендирования не павінна быць навалы бактэрый.Калі ёсць бактэрыяльныя згусткі, якія не старанна перамешаны, гэта паўплывае на лізіс, што прывядзе да нізкага выхаду і чысціні.Калі OD600 бактэрыяльнага раствора складае 0,65, рэкамендуецца выкарыстоўваць 7,5 мл буфера P1 пры экстракцыі з 150 мл бактэрыяльнага раствора;калі OD600 складае 0,75, трэба выкарыстоўваць 8 мл буфера P1 і адпаведна змяніць аб'ёмы буфераў P2 і P4.Пры павелічэнні аб'ёму бактэрыяльнага раствора да 200 мл рэкамендуеццааб'ём буфераў P1, P2 і P4 павялічваецца прапарцыйна.
3. Дадайце 7,5 мл буфера P2 да бактэрыяльнай завісі з кроку 2 і акуратна змяшайце ўверх і ўніз на працягу 6-8разоў і інкубаваць пры пакаёвай тэмпературы 4-5 хвілін.
Δ Акуратна перавярніце, каб старанна перамяшаць.Віхравы рух прывядзе да фрагментацыі геномнай ДНК, у выніку чаго фрагменты геномнай ДНК з'явяцца ў экстрагаванай плазмідзе.У гэты час раствор становіцца глейкім і напаўпразрыстым, паказваючы, што бактэрыі былі цалкам лізаваныя.Працягласць не павінна перавышаць 5 хвілін, каб пазбегнуць разбурэння плазмид.Калі раствор не празрысты, магчыма, у выніку занадта шмат бактэрыйняпоўны лізіс, таму колькасць бактэрый павінна быць адпаведна зменшана.
4. Дадайце 7,5 мл буфера P4 да бактэрыяльнай завісі з кроку 3 і неадкладна асцярожна перавярніце 6-8 разоў, каб раствор цалкам нейтралізаваў буфер P2.У гэты час павінен з'явіцца белы хлопьевидный асадак.Цэнтрыфугуйце пры хуткасці больш чым 11 000 абаротаў у хвіліну (12 000 × g) на працягу 10-15 хвілін, асцярожна перанясіце супернатант у новую круглодонную цэнтрыфужную прабірку аб'ёмам 50 мл (прыгатаваную самастойна) і пазбягайцеаспіраваць які плавае белы асадак.
Δ Дадайце буфер P4 і неадкладна перавярніце, каб добра змяшаць.Пакіньце прабірку стаяць, пакуль белы асадак раўнамерна не размяркуецца па растворы, каб прадухіліць адукацыю лакальных ападкаў, якія могуць паўплываць на нейтралізацыю.Калі перад цэнтрыфугаваннем няма раўнамернага белага хлопчатого асадка і супернатант не празрысты пасля цэнтрыфугавання, прабірку можна ачысціць.центрифугируют яшчэ 5 мін.
5. Дадайце 0,1 аб'ёму (10% ад аб'ёму супернатанту, каля 2,2 мл) эндатаксіну-паглынальніка ў супернатант з этапу 4 і перавярніце для змешвання.Змесціце раствор у ледзяную ванну або пастаўце ў здробнены лёд (або ў маразільную камеру халадзільніка) на 5 хвілін, пакуль раствор не зменіцца з каламутнага на празрысты і празрысты (ці яшчэзлёгку каламутнай), і перыядычна змешвайце некалькі разоў.
Δ Пасля таго, як у супернатант будзе дададзены сродак для паглынання эндатаксінаў, супернатант стане каламутным, алесупернатант павінен стаць празрыстым (або злёгку каламутным) пасля астуджэння ў ледзяной лазні.
6. Пасля таго як супернатант змясціць пры пакаёвай тэмпературы (>25 ℃) на 10-15 хвілін, ён стане каламутным, якяго тэмпература павышаецца да пакаёвай.Затым супернатант трэба перавярнуць, каб змяшаць.
Δ Калі пакаёвая тэмпература ніжэй або вы хочаце скараціць час экстракцыі, супернатант можна інкубаваць на вадзяной лазні пры тэмпературы 37 ~ 42 ℃ на працягу 5-10 хвілін, а наступны этап можна выканаць пасля супернатанту.становіцца каламутным.
7. Цэнтрыфугуйце супернатант прыкладна пры 11 000 абаротаў у хвіліну (12 000 × g) на працягу 10 хвілін пры пакаёвай тэмпературы (тэмпература павінна быць >25 ℃), каб аддзяліць фазу.Верхняя водная фаза змяшчае ДНК, у той час як ніжні сіні масляністы пласт змяшчае эндатаксіны і іншыя прымешкі.ПерадацьДНК-змяшчае водную фазу ў новую трубку іадкіньце масляністы пласт.
Δ Тэмпература падчас цэнтрыфугавання павінна быць вышэй за 25 ℃, паколькі эфектыўнага падзелу фаз не адбываеццаадбываецца, калі тэмпература занадта нізкая.
Δ Калі падзел фаз не эфектыўны, тэмпературу цэнтрыфугавання можна адрэгуляваць да 30 ℃ ічас цэнтрыфугавання можна павялічыць да 15 мін.
Δ Не высмоктвайце сіні масляністы пласт, бо ён змяшчае эндатаксіны і іншыя прымешкі.
Механізм
Ресуспензия Лізіс Нейтралізацыя
◇ Дадайце 7,5 мл буфера P1
◇ Дадайце 7,5 мл буфера P2
◇ Дадайце 7,5 мл буфера P4
Вывядзенне эндатаксінаў
◇ Дадайце 0,1 аб'ём супернатанту Endotoxin Scavenger
Пераплёт і мыццё
◇ Дадайце 0,5 аб'ёму ізапрапанолу
◇ Дадайце 10 мл буфера PW
◇ Дадайце 10 мл буфера PW
Элюцыя
◇ Дадайце 1 – 2 мл буфера TB або ddH2O без эндатаксінаў
