Зваротная транскрыптаза M-MLV Neoscript
Зваротная транскрыптаза Neoscript - гэта зваротная транскрыптаза, атрыманая шляхам скрынінга мутацый гена M-MLV паходжання і экспрэсіі віруса мышынага лейкозу Молоні ў E.coli.Фермент здымае актыўнасць РНКазы H, мае больш высокую тэмпературную талерантнасць і падыходзіць для высокатэмпературнай зваротнай транскрыпцыі.Такім чынам, гэта карысна для ліквідацыі неспрыяльнага ўздзеяння структуры высокага ўзроўню РНК і неспецыфічных фактараў на сінтэз кДНК, а таксама мае больш высокую стабільнасць і здольнасць да сінтэзу зваротнай транскрыпцыі.Фермент мае больш высокую стабільнасць і здольнасць да сінтэзу зваротнай транскрыпцыі.
Кампаненты
1.200 ЕД/мкл зваротнай транскрыптазы Neoscript
2.5 × буфер першай ніткі (неабавязкова)
* 5 × Буфер першай ніткі не ўтрымлівае dNTP, дадайце dNTP пры падрыхтоўцы рэакцыйнай сістэмы
Рэкамендаванае прымяненне
1.Аднаэтапная qRT-PCR.
2.РНК-выяўленне віруса.
Умовы захоўвання
-20°C для працяглага захоўвання, варта добра змяшаць перад ужываннем, пазбягаць частага замарожвання-адтавання.
Вызначэнне адзінкі
Адна адзінка змяшчае 1 нмоль dTTP за 10 хвілін пры 37°C з выкарыстаннем полі(A)•аліга(dT)25як шаблон/праймер.
Кантроль якасці
1.Электрафарэтычная чысціня SDS-PAGE больш за 98%.
2.Адчувальнасць да ўзмацнення, кантроль ад партыі да партыі, стабільнасць.
3.Адсутнасць экзагеннай нуклеазнай актыўнасці, адсутнасць экзагеннай эндануклеазы або забруджвання экзануклеазай
Настройка рэакцыі для першага рашэння Chain Reaction
1.Падрыхтоўка рэакцыйнай сумесі
| Кампаненты | Аб'ём |
| Аліга(dT)12-18 Буквар або Random Primerа Або генаспецыфічныя праймерыb | 50 пмоль |
| 50 пмоль (20-100 пмоль) | |
| 2 пмоль | |
| 10 мМ dNTP | 1 мкл |
| Матрычная РНК | Агульная РНК≤ 5 мкг;мРНК≤ 1 мкг |
| dH без РНКаз2O | Да 10 мкл |
Заўвагі:a/b: Выберыце розныя тыпы праймераў у адпаведнасці з вашымі эксперыментальнымі патрэбамі.
2.Награвайце пры 65°C на працягу 5 хвілін і хутка астуджайце на лёдзе на працягу 2 хвілін.
3.Дадайце наступныя кампаненты ў вышэйзгаданую сістэму да агульнага аб'ёму 20 мкл і акуратна змяшайце:
| Кампаненты | Аб'ём (мкл) |
| 5 × буфер першай ніткі | 4 |
| Зваротная транскрыптаза Neoscript (200 ЕД/мкл) | 1 |
| Інгібітар РНКазы (40 ЕД/мкл) | 1 |
| dH без РНКаз2O | Да 20 мкл |
4. Калі ласка, выканайце рэакцыю ў адпаведнасці з наступнымі ўмовамі:
(1) Калі выкарыстоўваецца Random Primer, рэакцыю трэба праводзіць пры 25 ℃ на працягу 10 хвілін, а затым пры 50 ℃ на працягу 30~60 хвілін;
(2) Калі выкарыстоўваюцца Oligo dT або спецыяльныя праймеры, рэакцыю трэба праводзіць пры 50 ℃ на працягу 30~60 хвілін.
5.Награвайце пры 95 ℃ на працягу 5 хвілін, каб інактываваць зваротную транскрыптазу Neoscript і спыніць рэакцыю.
6.Прадукты зваротнай транскрыпцыі могуць быць выкарыстаны непасрэдна ў рэакцыі ПЦР і колькаснай рэакцыі флуарэсцэнцыі ПЦР або захоўвацца пры -20 ℃ на працягу доўгага часу.
ПЦР Рдзеянне:
1.Падрыхтоўка рэакцыйнай сумесі
| Кампаненты | Канцэнтрацыя |
| 10 × ПЦР-буфер (без dNTP, без Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 мМ кожны dNTP) | 200 мкМ |
| 25 мм MgCl2 | 1-4 мм |
| Taq ДНК-палімераза (5U/мкл) | 2-2,5 U |
| Праймер 1 (10 мкМ) | 0,2-1 мкМ |
| Праймер 2 (10 мкМ) | 0,2-1 мкМ |
| Шаблона | ≤10% першага раствора ланцуговай рэакцыі (2 мкл) |
| ddH2O | Да 50 мкл |
Заўвагі:a: Калі дадаць занадта шмат раствора першай ланцуговай рэакцыі, рэакцыя ПЦР можа быць інгібіравана.
2.Працэдура ПЦР-рэакцыі
| Крок | тэмпература | Час | Цыклы |
| Папярэдняя дэнатурацыя | 95 ℃ | 2-5 хвілін | 1 |
| Дэнатурацыя | 95 ℃ | 10-20 сек | 30-40 |
| Адпал | 50-60 ℃ | 10-30 сек | |
| Пашырэнне | 72 ℃ | 10-60 сек |
Заўвагі
1.Падыходзіць для аптымізацыі тэмпературы зваротнай транскрыпцыі ў дыяпазоне 42℃~55℃.
2.Ён мае лепшую стабільнасць, падыходзіць для высокатэмпературнай ампліфікацыі зваротнай транскрыпцыі.Акрамя таго, гэта спрыяльна для эфектыўнага праходжання праз складаныя структурныя ўчасткі РНК.Акрамя таго, гэтападыходзіць для аднаэтапнай мультыплекснай флуарэсцэнтнай колькаснай RT-PCR дэтэкцыі.
3.Добрая сумяшчальнасць з рознымі ферментамі ПЦР-ампліфікацыі і падыходзіць для высокаадчувальных рэакцый ОТ-ПЦР.
4.Падыходзіць для высокай адчувальнасці аднаэтапнай флуарэсцэнтнай колькаснай рэакцыі RT-PCR, эфектыўна паляпшае хуткасць выяўлення нізкай канцэнтрацыі шаблонаў.
5.Падыходзіць для стварэння бібліятэк кДНК.
