Інгібітар Рназы
Інгібітар мышынай РНКазы - гэта рэкамбінантны інгібітар мышынай РНКазы, экспрэсіраваны і вычышчаны з E.coli.Ён звязваецца з РНКазой A, B або C у суадносінах 1:1 праз некавалентную сувязь, тым самым інгібіруючы актыўнасць трох ферментаў і абараняючы РНК ад дэградацыі.Аднак ён не эфектыўны супраць РНКазы 1, РНКазы Т1, нуклеазы S1, РНКазы Н або РНКазы Aspergillus.Інгібітар мышынай РНКазы быў пратэставаны з дапамогай RT-PCR, RT-qPCR і IVT мРНК і быў сумяшчальны з рознымі камерцыйнымі зваротнымі транскрыптазамі, ДНК-палімеразамі і РНК-палімеразамі.
У параўнанні з інгібітарамі РНКазы чалавека мышыны інгібітар РНКазы не ўтрымлівае двух цыстэінаў, якія вельмі адчувальныя да акіслення, якое выклікае інактывацыю інгібітара.Гэта робіць яго стабільным пры нізкіх канцэнтрацыях DTT (менш за 1 ммоль).Гэта асаблівасць робіць яго прыдатным для выкарыстання ў рэакцыях, дзе высокія канцэнтрацыі DTT неспрыяльныя для рэакцыі (напрыклад, RT-PCR у рэальным часе).
Aпрымяненне
Гэты прадукт можа быць шырока выкарыстаны ў любых эксперыментах, дзе магчыма ўмяшанне РНКазы, каб пазбегнуць дэградацыі РНК, напрыклад:
1.Сінтэз першага ланцуга кДНК, RT-PCR, RT-qPCR і інш.
2.Абараняе РНК ад дэградацыі падчас транскрыпцыі/трансляцыі in vitro (напрыклад, сістэма рэплікацыі віруса in vitro).
3.Інгібіраванне актыўнасці РНКазы падчас падзелу і ачысткі РНК.
Умовы захоўвання
Прадукт можна захоўваць пры -25～- 15 ℃, тэрмін дзеяння - 2 гады.
Буфер для захоўвання
50 мм KCl, 20 мм HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 мм DTT і 50% гліцэрыны.
Вызначэнне адзінкі
Колькасць мышынага інгібітара РНКазы, неабходнага для інгібіравання актыўнасці 5 нг рыбануклеазы А на 50%, вызначалася як адна адзінка (U).
Малекулярная маса бялку
Малекулярная маса мышынага інгібітару РНКазы складае 50 кДа.
Кантроль якасці
Экзануклеаза дзейнасць:
40 ЕД інгібітару мышынай РНКазы з 1 мкг λ-Hind III расшчапляюць ДНК пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін, што вызначана электрафарэзам у агарозным гелі, не прыводзіць да дэградацыі.
Эндануклеазная актыўнасць:
40 ЕД інгібітара мышынай РНКазы з 1 мкг λ ДНК пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін не прыводзяць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.
Насяканне дзейнасць:
40 ЕД інгібітара мышынай РНКазы з 1 мкг pBR322 пры 37 ℃ на працягу 16 гадзін не прыводзіць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.
РНКаза актыўнасць:
40U інгібітару мышынай РНКазы з 1,6 мкг MS2 РНК на працягу 4 гадзін пры 37 ℃ не прыводзіць да дэградацыі, як вызначана электрафарэзам у агарозным гелі.
E.ДНК coli:
40 ЕД мышынага інгібітара РНКазы правяраюць на наяўнасць геномнай ДНК E. coli з дапамогай кПЦР TaqMan з праймерамі, спецыфічнымі для локуса 16S рРНК E. coli.Забруджванне геномнай ДНК E. coli складае ≤ 0,1 пг/40 ЕД.
Nнататкаs
1. Моцнае ваганне або перамешванне прывядзе да інактывацыі фермента.
2. Аптымальны дыяпазон тэмператур для гэтага інгібітара быў 25-55 ℃, і ён быў інактываваны пры 65 ℃ і вышэй.
3. Дзейнасць РНКазы Н, РНКазы 1 і РНКазы Т1 не інгібіруецца інгібітарам мышынай РНКазы.
4. Інгібіраванне актыўнасці РНКазы было выяўлена ў шырокім дыяпазоне рн (рн 5-9 усе былі актыўнымі), а самая высокая актыўнасць назіралася пры рн 7-8.
5. Паколькі рыбануклеазы звычайна захоўваюць актыўнасць ва ўмовах дэнатурацыі, трэба быць асцярожным, каб пазбегнуць дэнатурацыі малекул інгібітараў РНКазы, якія ўтварылі комплекс з рыбануклеазай.Каб прадухіліць вызваленне актыўнай рыбануклеазы, варта пазбягаць тэмператур вышэй за 50 °C і высокіх канцэнтрацый мачавіны або іншых дэнатуруюць агентаў.
