Зваротная транскрыптаза M-MLV
RevScript Зваротная транскрыптаза атрымана метадам геннай інжынерыі.Ён мае больш высокую здольнасць да сінтэзу кДНК, тэрмаўстойлівасць і мяжа тэмпературы рэакцыі (да 60 ° C).Сінтэзаваны прадукт кДНК мае памер да 10 кб.Гэта павышае сродство шаблонаў і падыходзіць для зваротнай транскрыпцыі шаблонаў РНК са складанай другаснай структурай або генамі з нізкім узроўнем капіравання.
Кампаненты
| Кампанент | HC2003Б (10 000U) | HC2003Б (5*10 000U) | HC2003Б (200 000U) |
| Зваротная транскрыптаза RevScript (200U/мкл) | 50 мкл | 5×50 мкл | 1 мл |
| 5 × буфер RevScript | 250 мкл | 1,25 мл | 5 мл |
Умовы захоўвання
Гэты прадукт варта захоўваць пры -25°C~-15°C на працягу 2 гадоў.
Вызначэнне адзінкі
Адна адзінка ўключае 1 нмоль dTTP у нерастваральны ў кіслаце матэрыял за 10 хвілін пры 37°C з выкарыстаннем Oligo(dT) у якасці праймераў.
Налада рэакцыі
1.Дэнатурацыя матрыцы РНК (Гэты этап неабавязковы, дэнатурацыя матрыцы РНК дапамагае адкрыць другасныя структуры, што палепшыць выхад кДНК першага ланцуга.)
| Кампаненты | Аб'ём (мкл) |
| ddH без РНКазы2O | Да 13 |
| Аліга(dT)18 (50 мкмоль/л) або выпадковы праймер (50 мкмоль/л) Або генаспецыфічныя праймеры (2 мкмоль/л) | 1 |
| або 1 | |
| або 1 | |
| Шаблон РНК | X a |
Заўвагі:
1) а: Агульная РНК: 1-5 мкг або мРНК: 1-500 нг
2) Інкубуйце пры 65°C на працягу 5 хвілін, затым неадкладна перанясіце на лёд для астуджэння на 2 хвіліны.Кароткае цэнтрыфугаванне, каб сабраць рэакцыйную вадкасць, дадаць раствор для рэакцыі зваротнай транскрыпцыі, як паказана ў наступнай табліцы.Акуратна піпеткай змяшайце.
1.Падрыхтоўка рэакцыйнай сумесі (аб'ём 20 мкл)
| Кампаненты | Аб'ём (мкл) |
| Сумесь папярэдняга кроку | 13 |
| 5×Буфер | 4 |
| Сумесь dNTP (10 нмоль/л) | 1 |
| Зваротная транскрыптаза (200 ЕД/мкл) | 1 |
| Інгібітар РНКазы (40 ЕД/мкл) | 1 |
1.Правядзіце рэакцыю ў наступных умовах:
| Тэмпература (°C) | Час |
| 25 °Ca | 5 хвілін |
| 42 °Cb | 15-30 хвілін |
| 85 °Cc | 5 хвілін |
Заўвагі:
1) а.Інкубацыя пры 25°C на працягу 5 хвілін патрабуецца толькі для выкарыстання выпадковых гексамераў.Калі ласка, прапусціце гэты крок пры выкарыстанні Oligo (dT)18або Gene Specific Primer.
2) б.Рэкамендуемая тэмпература зваротнай транскрыпцыі складае 42°C. Для шаблонаў са складанай другаснай структурай або высокім утрыманнем GC рэкамендуецца павысіць тэмпературу рэакцыі да 50-55°C.
3) в.Награванне пры 85 ° C на працягу 5 хвілін для інактывацыі зваротнай транскрыптазы.
4) Прадукт можна непасрэдна выкарыстоўваць у рэакцыях ПЦР або кПЦР або захоўваць пры -20°C для кароткачасовага захоўвання.Рэкамендуецца выраўноўваць прадукты і захоўваць пры тэмпературы -80°C для працяглага захоўвання.Пазбягайце частага замарожвання-адтавання.
5) Прадукт падыходзіць для аднаэтапнай RT-qPCR, рэкамендуецца дадаваць 10-20 ЕД зваротнай транскрыптазы на кожныя 25 мкл рэакцыйнай сістэмы або паступова павялічваць колькасць зваротнай транскрыптазы ў адпаведнасці з рэальнай сітуацыяй.
Заўвагі
1.Калі ласка, падтрымлівайце эксперыментальную зону ў чысціні;Падчас працы неабходна насіць чыстыя пальчаткі і маскі.Усе расходныя матэрыялы, якія выкарыстоўваюцца ў эксперыменце, не павінны ўтрымліваць РНКазы, каб прадухіліць заражэнне РНКазамі.
2.Усе працэдуры варта праводзіць на лёдзе, каб прадухіліць дэградацыю РНК.
3.Для забеспячэння высокай эфектыўнасці зваротнай транскрыпцыі рэкамендуюцца ўзоры РНК высокай якасці.
4.Гэты прадукт прызначаны толькі для даследчага выкарыстання.
5.Для вашай бяспекі працуйце ў лабараторных халатах і аднаразовых пальчатках.
