Набор для прамой ПЦР раслін

Кат. №: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit падыходзіць для прамой ампліфікацыі лісця раслін, насення і г.д. і можа выкарыстоўвацца для высокапрадукцыйнага скрынінга ўзораў раслін, якія не ўтрымліваюць поліцукрыды і поліфенолы.ДНК-палімераза прамой ампліфікацыі, заснаваная на накіраванай эвалюцыі, мае найвышэйшую талерантнасць да інгібітараў ПЦР у раслін.У той жа час ён падтрымлівае высокую прадукцыйнасць ампліфікацыі, якая падыходзіць для ампліфікацыі фрагментаў ДНК у межах 5 кб.Унікальны буфер для лізісу А ў камплекце можна выкарыстоўваць для лізісу свежых або замарожаных раслінных тканін.Ён просты ў кіраванні, і лізат можна выкарыстоўваць у якасці шаблону для ампліфікацыі без ачысткі.Сістэма змяшчае ахоўныя рэчывы, якія дазваляюць эфектыўна ўзмацняць узоры сыравіны пасля шматразовага замарожвання і адтавання.2 × Plant Direct Master Mix трэба толькі дадаць праймеры і шаблоны для выканання рэакцыі ампліфікацыі, тым самым скарачаючы аперацыі піпетавання і паляпшаючы прапускную здольнасць выяўлення і ўзнаўляльнасць вынікаў.

Кампаненты

*Plant Direct Lysis Buffer B - гэта дадатковы рэагент, які выкарыстоўваецца для нейтралізацыі Plant Direct Lysis Buffer A для падаўжэння часу захоўвання ўзораў.Яго можна выкарыстоўваць у адпаведнасці з рэальнай сітуацыяй.

Умовы захоўвання

2 × Plant Direct Master Mix, захоўваць пры -30 ~ -15 ℃ і пазбягаць паўторнага замарожвання і адтавання;Раслінны буфер прамога лізісу, захоўваць пры -30 ~ -15 ℃ або 2 ~ 8 ℃.

Працэс эксперыменту

Апрацоўка ўзораў–Ліст расліны

Прамы метад:Рэкамендуецца выкарыстоўваць маладыя лісце.Выкарыстоўвайце дзіракол з фіксаваным дыяметрам 0,5 - 3 мм, каб атрымаць невялікі і аднастайны ўзор, а затым непасрэдна дадайце ўзор у сістэму ПЦР (рэкамендуецца сістэма 50 мкл).Звярніце ўвагу, пераканайцеся, што ўзор знаходзіцца ў растворы ПЦР, а не прылягае да сценкі прабіркі.Калі прамая ПЦР выкарыстоўваецца для ампліфікацыі доўгіх фрагментаў і складаных узораў, выкарыстанне ўзору з меншым дыяметрам (0,5-1 мм) у якасці шаблону можа дапамагчы атрымаць лепшыя вынікі.

Метад драбнення лізіс:Рэкамендуецца выкарыстоўваць маладыя лісце.Вазьміце невялікі кавалачак ліста (прыблізна 1-3 мм у дыяметры), змесціце яго ў 20 мкл буфера для прамога лізісу раслін Ab і здрабніце яго як мага мацней (гэты крок можна зрабіць, сціснуўшы ліст наканечнікам піпеткі на 100 мкл расцерці ўзор) .Калі выкарыстоўваюцца большыя аб'ёмы ліставай тканіны (не перавышаюць 7 мм), павялічце аб'ём буфера для развядзення да 50 мкл.Пасля здрабнення лісця раствор павінен быць зялёным.Пасля кароткага цэнтрыфугавання дадайце 1 мкл супернатанту ў сістэму ПЦР у якасці шаблону рэакцыіc.

Метад тэрмічнага лізісу:Рэкамендуецца выкарыстоўваць маладыя лісце.Вазьміце невялікі кавалачак ліста (прыблізна 1-3 мм у дыяметры), змесціце яго ў 20 мкл буфера для прамога лізісу раслін А і нагрэйце яго пры 95°C на працягу 5-10 хвілін.Для лісця, якое цяжка паддаецца лізісу, час лізісу можа быць адпаведным чынам падоўжаны (не больш за 20 хвілін).Калі выкарыстоўваюцца большыя аб'ёмы ліставай тканіны (не перавышаюць 7 мм), павялічце аб'ём буфера для развядзення да 50 мкл.Пасля награвання ненадоўга адцэнтрыфугуйце і дадайце 1 мкл супернатанта ў сістэму ПЦР у якасці рэакцыйнай матрицыb.

Апрацоўка ўзораў– Насенне раслін

Метад драбнення лізіс:Скальпелем разрэжце насенне дыяметрам 5 мм, дадайце іх у 100 мкл буфера для прамога лізісу раслін A і здрабніце ўзор наканечнікам піпеткі або іншымі інструментамі.Каротка змяшайце і дайце пастаяць пры пакаёвай тэмпературы 3-5 хвілін.Пераканайцеся, што ўзор насення пагружаны ў буфер для развядзення.Пасля кароткага цэнтрыфугавання дадайце 1 мкл супернатанта ў сістэму ПЦР у якасці рэакцыйнай матрицы.

Метад тэрмічнага лізісу:Скальпелем разрэжце насенне дыяметрам 5 мм, дадайце іх у 100 мкл расліннага буфера для прамога лізісу А і награвайце пры 95°C на працягу 5-10 хвілін.Для лісця, якое цяжка паддаецца лізісу, час лізісу можа быць адпаведным чынам падоўжаны (не больш за 30 хвілін).Пасля награвання ненадоўга адцэнтрыфугуйце і дадайце 1 мкл супернатанта ў сістэму ПЦР у якасці рэакцыйнай матрицыb.

а.Нажніцы або іншыя інструменты таксама можна выкарыстоўваць для выразання ўзораў патрэбнага памеру;калі перфаратар або нажніцы выкарыстоўваюцца паўторна, іх трэба ачысціць 2% растворам гіпахларыту натрыю перад кожным выкарыстаннем, каб прадухіліць перакрыжаванае забруджванне паміж узорамі.

б.Перад выкарыстаннем пераканайцеся, што буфер прамога лізісу раслін цалкам расплавіўся.Калі буфер глейкі або мае асадак, яго можна нагрэць да 37 ℃, каб цалкам расплавіць перад выкарыстаннем.

в.Аб'ём шаблону ў рэакцыйнай сістэме можа быць адпаведна адрэгуляваны ў залежнасці ад розніцы ў аб'ёме расліннага матэрыялу і дададзенага растваральніка.

Буфер прамога лізісу раслін

Буфер прамога лізісу раслін А, які змяшчаецца ў гэтым прадукце, быў строга аптымізаваны для вызвалення геному большасці раслінных тканак і падыходзіць для кароткачасовага захоўвання неапрацаваных раслін пры тэмпературы 4 ℃.Калі ўзор неабходна захоўваць на працягу больш доўгага перыяду часу (напрыклад, 1-2 месяцы), рэкамендуецца перанесці супернатант у новую прабірку EP і захоўваць яго пры -20 ℃.Для больш стабільнага захоўвання ўзораў дадайце роўны аб'ём расліннага буфера прамога лізісу B у перанесены супернатант, добра змяшайце і захоўвайце пры -20 ℃.Стабільны час захоўвання залежыць ад узораў раслін і стану.

Сістэма рэакцыі

а.Ён змяшчае Mg²⁺у канчатковай канцэнтрацыі 2 мМ.

б.Рэкамендуецца выкарыстоўваць канчатковую канцэнтрацыю 0,4 мкМ для кожнага праймера.Празмернае выкарыстанне праймераў прывядзе да ўзмацнення неспецыфічнай ампліфікацыі.

в.Колькасць выкарыстоўванай пробы можна рэгуляваць у залежнасці ад рэальнай сітуацыі.Колькасць, якая выкарыстоўваецца ў адной рэакцыі сырога лізаванага ўзору, можа быць адрэгулявана ў межах ад 2% да 20% ад агульнага аб'ёму рэакцыі.Выкарыстанне занадта вялікай колькасці ўзораў можа прывесці да збою ўзмацнення.

Праграму рэакцыі

а.Пачатковая дэнатурацыя (98 ℃, 5 хвілін) спрыяе лізісу расліннай тканіны, вызваляючы геномную ДНК, якую можна выкарыстоўваць для ПЦР-ампліфікацыі.Не скарачайце час і не зніжайце тэмпературу.

б.Рэкамендуецца ўсталёўваць яго роўным значэнню Tm грунтоўкі або на 2 ~ 4 ℃ вышэй, чым значэнне Tm.ДНК-палімераза прамой ампліфікацыі, якая выкарыстоўваецца ў гэтым прадукце, адрозніваецца ад звычайнай ДНК-палімеразы Taq і мае асаблівыя патрабаванні да тэмпературы рэакцыі адпалу； выкарыстанне высокай тэмпературы адпалу можа эфектыўна паменшыць неспецыфічную ампліфікацыю і палепшыць эфектыўнасць ампліфікацыі.Для складаных шаблонаў эфектыўнае ўзмацненне можа быць дасягнута шляхам рэгулявання тэмпературы адпалу і падаўжэння часу падаўжэння.

в.Калі даўжыня прадукту ампліфікацыі ≤1 кб, час падаўжэння задаецца 30 сек/кб;калі даўжыня прадукту ампліфікацыі складае >1 кб, час падаўжэння задаецца 60 сек/кб.

d.Для складаных узораў або ўзораў з нізкім выхадам узмацнення колькасць цыклаў можа быць належным чынам павялічана да 40-50 цыклаў.

Прыкладанні

Ён прымяняецца для прамой ампліфікацыі раслінных тканін і высокапрадукцыйнага скрынінга раслінных узораў, якія не ўтрымліваюць поліцукрыдаў і поліфенолаў.

Заўвагі

Толькі для даследчага выкарыстання.Не для выкарыстання ў дыягнастычных працэдурах.

1. Для грубай ампліфікацыі раслін або прамой ампліфікацыі рэкамендуецца выкарыстоўваць вычышчаную геномную ДНК у якасці станоўчага кантролю перад пачаткам эксперыменту, каб пераканацца, што сістэма, праймеры і аперацыі правільныя.

2. ДНК-палімераза прамой ампліфікацыі, якая выкарыстоўваецца ў гэтым наборы, мае моцную карэктурную актыўнасць.Калі неабходна выканаць кланаванне ТА, рэкамендуецца ачысціць ДНК перад даданнем аденіну.

3. Кіраўніцтва па дызайне грунтоўкі:

а.Рэкамендуецца, каб апошняя аснова на 3'-канцы праймера была G або C.

б.Варта пазбягаць паслядоўных несупадзенняў у апошніх 8 базах на 3'-канцы праймера.в.Пазбягайце шпілек на 3' канцы грунтоўкі.

d.Адрозненні ў значэнні Tm праймера прамога і зваротнага праймера не павінны перавышаць 1 ℃, а значэнне Tm павінна быць адрэгулявана да 60 ~ 72 ℃ (для разліку значэння Tm рэкамендуецца Primer Premier 5).

д.Дадатковыя дадатковыя паслядоўнасці праймераў, якія не супадаюць з шаблонам, не павінны ўключацца пры разліку значэння Tm праймера.

е.Рэкамендуецца, каб утрыманне GC у грунтоўцы было 40% -60%.

г.Агульнае размеркаванне A, G, C і T у грунтоўцы павінна быць максімальна раўнамерным.Пазбягайце выкарыстання рэгіёнаў з высокім утрыманнем GC або AT.

ч.Пазбягайце прысутнасці камплементарных паслядоўнасцей з 5 або больш асноў унутры праймера або паміж двума праймерамі і пазбягайце прысутнасці камплементарных паслядоўнасцей з 3 або больш асноў на 3'-канцы двух праймераў.

я.Выкарыстоўвайце функцыю NCBI BLAST, каб праверыць спецыфічнасць праймера, каб прадухіліць неспецыфічнае ўзмацненне.