Урацил ДНК-гликозилаза
Урацил-ДНК-гликозилаза (УНГ або УДГ) - рэкамбінантныя клон E.coli з малекулярнай масай 25 кДа.Ён каталізуе вызваленне вольнага урацылу з адналанцуговай і двухланцуговай ДНК, якая змяшчае урацыл, неактыўны ў дачыненні да РНК і можа быць выкарыстаны для прадухілення заражэння прадуктаў ПЦР-ампліфікацыі.Прынцып дзеяння заснаваны на тым факце, што калі ў рэакцыі ПЦР замяніць dTTP на dUTP і ўтварыць прадукт ампліфікацыі ПЦР, які змяшчае падставы dU, фермент можа селектыўна разрываць глікозідную сувязь падстаў U у адна- і двухцепочечных падставах. ДНК і дэградаваць прадукт ампліфікацыі ПЦР.
Рэкамендаванае прымяненне
Узмацненне прафілактыкі заражэння
Умовы захоўвання
-20°C для працяглага захоўвання, варта добра змяшаць перад ужываннем, пазбягаць частага замарожвання-адтавання.
Буфер для захоўвання
20 мм Tris-HCl (pH 8,0), 150 мм NaCl, 1 мм ЭДТА, 1 мм DTT, стабілізатар, 50% гліцэрына.
Вызначэнне адзінкі
Колькасць фермента, неабходная для раскладання 1 мкг адналанцуговай ДНК, якая змяшчае падставы dU, за 1 гадзіну пры 37°C складае 1 адзінку.
Кантроль якасці
1.Электрафарэтычная чысціня SDS-PAGE больш за 98%
2.Адчувальнасць да ўзмацнення, кантроль ад партыі да партыі, стабільнасць
3.Пасля апрацоўкі 1U UNG пры тэмпературы 50 ℃ на працягу 2 хвілін шаблон, які змяшчае U ніжэй за 103 копіі, павінен быць цалкам дэградаваны, і прадукт ампліфікацыі не можа быць атрыманы
4.Няма экзагеннай нуклеазной актыўнасці
Інструкцыя
| Кампаненты | Аб'ём (мкл) | Канчатковая канцэнтрацыя |
| 10 × ПЦР-буфер (без dNTP, Mg²+бясплатна) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 мкМ |
| dUTP (замяніць dTTP) | - | 200-600 мкМ |
| 25 мм MgCl2 | 2-8 мкл | 1-4 мм |
| 5 ЕД/мкл Taq | 0,25 | 1,25 У |
| 5 ЕД/мкл UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Сумесь грунтоўкіа | 2 | 1× |
| Шаблон | - | <1 мкг/рэакцыю |
| ddH₂O | Да 50 | - |
нататка: a: Калі выкарыстоўваецца для qPCR/qRT-PCR, флуоресцентный зонд трэба дадаць у рэакцыйную сістэму.Звычайна канчатковая канцэнтрацыя праймера 0,2 мкМ можа даць добрыя вынікі;калі прадукцыйнасць рэакцыі дрэнная, канцэнтрацыю праймера можна рэгуляваць у дыяпазоне 0,2-1 мкМ.Звычайна канцэнтрацыя зонда аптымізуецца ў дыяпазоне 0,1-0,3 мкМ.Можна правесці эксперыменты з градыентам канцэнтрацыі, каб знайсці найлепшае спалучэнне праймера і зонда.
Заўвагі
1.Фермент UNG можна выкарыстоўваць для выдалення забруджаных прадуктаў ампліфікацыі dUTP з рэакцыйнай сістэмы перад рэакцыяй ампліфікацыі ПЦР, каб потым пазбегнуць прытворнададатных вынікаў з-за забруджвання прадуктам.
2.Аптымальная тэмпература для фермента UNG, які выкарыстоўваецца ў рэакцыі ПЦР супраць заражэння, звычайна складае 50 ℃ на працягу 2 хвілін;умова інактывацыі - 95 ℃ на працягу 5 хвілін.
3.Пазбягайце частага замарожвання-адтавання і не падвяргайце моцным ваганням тэмпературы.
4.Розныя гены, якія падлягаюць ампліфікацыі, маюць розную эфектыўнасць выкарыстання dUTP і адчувальнасць да фермента UNG, таму, калі выкарыстанне сістэмы UNG прыводзіць да зніжэння адчувальнасці выяўлення, рэакцыйную сістэму неабходна наладзіць і аптымізаваць. Калі вам патрэбна тэхнічная падтрымка, звяртайцеся нашай кампаніі.
