2×Sensi Direct Premix-UNG (зонд кПЦР)
Кат. №: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) прызначаны для правядзення ПЦР непасрэдна з узораў без экстракцыі ДНК або падрыхтоўкі ўзораў.Гэты рэагент складаецца з ДНК-палімеразы гарачага старту, урацылавай ДНК-гліказілазы (UNG), інгібітара РНКазы, MgCl2, dNTP (з dUTP замест dTTP) і стабілізатары для колькаснай ПЦР (кПЦР).Гэты рэагент забяспечвае высокую талерантнасць да інгібітараў, і, такім чынам, яго можна непасрэдна ўжываць для выяўлення ўзораў, такіх як мазок з горла, сліна, антыкаагулянтная суцэльная кроў, плазма і сыроватка без экстракцыі ДНК.Рэагент выкарыстоўвае запатэнтаваны буфер для кПЦР са змешанымі ферментамі антыінгібітарнай ДНК-палімеразы і фермента UNG.Такім чынам, ён можа атрымаць добрую ампліфікацыю генаў-мішэняў ва ўзорах, якія змяшчаюць інгібітары, і інгібіраваць ілжывададатную ампліфікацыю, выкліканую рэшткавым ПЦР і аэразольным забруджваннем.Гэты рэагент сумяшчальны з большасцю флуоресцентных колькасных прыбораў для ПЦР, такіх як Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche і г.д.
Кампаненты
1. 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix
2. Буфер папярэдняга змешвання 2×SensiDirect (dUTP)
Умовы захоўвання
Усе кампаненты павінны захоўвацца пры -20 ℃ для працяглага захоўвання і 4 ℃ да 3 месяцаў.Калі ласка, старанна змяшайце пасля адтавання і цэнтрыфугу перад выкарыстаннем.Пазбягайце частага замарожвання-адтавання.
Велапратакол
| Крок | тэмпература | Час | Цыкл |
| Страваванне | 50 ℃ | 2 хвіліны | 1 |
| Актывацыя палімеразы | 95 ℃ | 1-5 хвілін | 1 |
| Дэнатурацыя | 95 ℃ | 10-20-я гады | 40-50 |
| Адпал/Пашырэнне | 56-64 ℃ | 20-60-я гады |
Інструкцыя па піпетцы
| Рэагент | Аб'ём пер рэакцыя | Аб'ём на рэакцыю | Канчатковая канцэнтрацыя |
| 2 × буфер папярэдняга змешвання SensiDirect (dUTP) | 12,5 мкл | 25 мкл | 1× |
| 50×SensiDirect Enzyme/UNG Mix | 0,5 мкл | 1 мкл | 1× |
| 25× Сумесь грунтоўкі і зонда1, 2 | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Узор3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Агульны аб'ём | 25 мкл | 50 мкл | - |
1. Канчатковая канцэнтрацыя праймера звычайна складае 0,2 мкМ.Для дасягнення лепшых вынікаў канцэнтрацыю праймера можна аптымізаваць у дыяпазоне 0,2-1 мкМ.
2. Як правіла, канцэнтрацыю зонда можна аптымізаваць у дыяпазоне 0,1-0,3 мкМ.Аптымальная канцэнтрацыя зонда залежыць ад прыбора ПЦР-ампліфікацыі ў рэжыме рэальнага часу, тыпу зонда і тыпу флуоресцентного рэчыва для маркіроўкі.Калі ласка, звярніцеся да інструкцыі да прыбора або да канкрэтных патрабаванняў да кожнага флуоресцентного зонда.
3. Розныя тыпы ўзораў утрымліваюць розныя тыпы і ўтрыманне інгібітараў і колькасць копій мэтавага гена.Аб'ём выбаркі павінен разглядацца ў адпаведнасці з фактычным станам.Пры неабходнасці развядзіце ўзор, дадаўшы ваду без нуклеазы або TE буфер.
4. Рэкамендаваны аб'ём розных узораў:
| Узор | Аб'ём на аднаго 50 мкл рэакцыя | Максімум суадносіны |
| Антикоагулянт суцэльнай крыві | 2,5 мкл | 5% |
| плазма | 15 мкл | 30% |
| Сыроватка | 10 мкл | 20% |
| Мазок з горла | 10 мкл | 20% |
| Сліна | 10 мкл | 20% |
Кантроль якасці
1. Выяўленне функцый: адчувальнасць, спецыфічнасць і паўтаральнасць КПЦР.
2. Адсутнасць экзагеннай нуклеазнай актыўнасці: адсутнасць экзагеннай эндануклеазы і забруджвання экзануклеазай.
Заўвагі да прадукту
1. У гэтым прадукце выкарыстоўваецца новы тып ДНК-палімеразы гарачага старту, якая можа быць актывавана за 1-5 хвілін. Паколькі яго рэакцыйны буфер быў аптымізаваны, ён больш падыходзіць для колькаснай ПЦР з падвойнай або множнай флуарэсцэнцыяй з выкарыстаннем зондавага метаду.
2. Калі значэнне Rn ПЦР-ампліфікацыі занадта нізкае або ампліфікацыя відавочна інгібіравана, памяншэнне колькасці ўзору, павелічэнне аб'ёму рэакцыі або папярэдняе развядзенне ўзору можа палепшыць вынікі.
3. Збор крыві, сліны, мачы, мазка з горла і г. д. павінен адпавядаць патрабаванням клінічных крытэрыяў, а свежы ўзор можна выкарыстоўваць для прадухілення дэградацыі нуклеінавых кіслот.
4. Паколькі розныя ампліконы маюць розную эфектыўнасць выкарыстання для dUTP і адчувальнасць да UNG, рэагенты павінны быць аптымізаваны, калі адчувальнасць выяўлення зніжаецца пры выкарыстанні сістэмы UNG.Пры неабходнасці звяжыцеся з намі для атрымання тэхнічнай падтрымкі.
5. Каб пазбегнуць ампліфікацыі перанесеных ПЦР-прадуктаў паміж аднаэтапнымі рэакцыямі, для ампліфікацыі патрабуецца спецыяльная эксперыментальная зона і піпетка.Працуйце ў пальчатках, часта мяняйце іх і не адкрывайце рэакцыйную прабірку пасля ПЦР-ампліфікацыі.
