Пратэіназа K mNGS (вадкая)
Пратэіназа K - гэта стабільная серын-пратэаза з шырокай субстратнай спецыфічнасцю.Ён расшчапляе многія бялкі ў натыўным стане нават у прысутнасці мыйных сродкаў.Дадзеныя даследаванняў крышталічнай і малекулярнай структуры паказваюць, што фермент належыць да сямейства субтылізінаў з каталітычнай трыядай актыўнага цэнтра (Asp39-Яго69-Сэр224).Пераважным месцам расшчаплення з'яўляецца пептыдная сувязь, прылеглая да карбаксільнай групе аліфатычных і араматычных амінакіслот з блакаванымі альфа-амінагрупамі.Ён звычайна выкарыстоўваецца з-за сваёй шырокай спецыфікі.Гэтая протеиназа K спецыяльна распрацавана для mNGS.У параўнанні з іншай пратэіназай K, яна ўтрымлівае нават менш забруджвання нуклеінавай кіслатой пры такой жа ферментатыўнай прадукцыйнасці, што можа лепш забяспечыць наступнае прымяненне mNGS.
Умовы захоўвання
2-8 ℃ на працягу 2 гадоў
Спецыфікацыя
| Знешні выгляд | Вадкасць ад бескаляровага да светла-карычневага |
| актыўнасць | ≥800 ЕД/мл |
| Канцэнтрацыя бялку | ≥20 мг/мл |
| Нікасэ | Нічога не выяўлена |
| ДНКаза | Нічога не выяўлена |
| РНКаза | Нічога не выяўлена |
Уласцівасці
| Нумар EC | 3.4.21.64(Рэкамбінант з альбому Tritirachium) |
| Ізаэлектрычная кропка | 7,81 |
| Аптымальны pH | 7,0- 12,0 Мал. 1 |
| Аптымальная тэмпература | 65 ℃ Мал. 2 |
| стабільнасць pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 гадзін) Мал. 3 |
| Тэрмастабільнасць | Ніжэй за 50 ℃ (pH 8,0, 30 хвілін) Мал. 4 |
| Стабільнасць пры захоўванні | Больш за 90% актыўнасці на працягу 12 месяцаў пры 25 ℃ |
| Актыватары | SDS, мачавіна |
| Інгібітары | Диизопропилфторфосфат;фенилметилсульфонилфторид |
Прыкладанні
1. Набор для генетычнай дыягностыкі
2. Наборы для экстракцыі РНК і ДНК
3. Выманне небялковых кампанентаў з тканін, дэградацыя бялковых прымешак, такіх як ДНКвакцыны і прэпараты гепарыну
4. Атрыманне храмасомнай ДНК метадам імпульснага электрафарэзу
5. Вестэрн-блот
6. Ферментатыўныя гликозилированные альбумін рэагенты дыягностыкі in vitro
Меры засцярогі
Апранайце ахоўныя пальчаткі і акуляры пры выкарыстанні або ўзважванні і захоўвайце добрае праветрыванне пасля выкарыстання.Гэты прадукт можа выклікаць скурную алергічную рэакцыю і сур'ёзнае раздражненне вачэй.Пры ўдыханні гэта можа выклікаць сімптомы алергіі або астмы або дыхавіцу.Можа выклікаць раздражненне дыхальных шляхоў.
Вызначэнне адзінкі
Адна адзінка (U) вызначаецца як колькасць фермента, неабходнага для гідралізу казеіну для атрымання 1 мкмольтыразіну ў хвіліну пры наступных умовах.
Падрыхтоўка рэагентаў
Рэагент I: 1 г казеіну малака раствараюць у 50 мл 0,1 М раствора фасфату натрыю (рН 8,0), інкубуюць у вадзе пры 65-70 ℃ на працягу 15 хвілін, змешваюць і раствараюць, астуджаюць вадой, даводзяць рн гідраксідам натрыю да 8,0 і фіксуюць аб'ём. 100 мл.
Рэагент II: 0,1 М трихлоруксусной кіслаты, 0,2 М ацэтату натрыю, 0,3 М воцатнай кіслаты.
Рэагент III: 0,4 М Na2CO3рашэнне.
Рэагент IV: рэагент форынт, разведзены чыстай вадой у 5 разоў.
Рэагент V: разбаўляльнік фермента: 0,1 М раствор фасфату натрыю (pH 8,0).
Рэагент VI: раствор тыразіну: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 мкмоль/мл тыразіну, растворанага ў 0,2М HCl.
Працэдура
1. 0,5 мл рэактыва I папярэдне падаграваюць да 37 ℃, дадаюць 0,5 мл раствора фермента, добра змешваюць і інкубуюць пры37 ℃ на працягу 10 хвілін.
2. Дадайце 1 мл рэагента II, каб спыніць рэакцыю, добра змяшайце і працягвайце інкубацыю на працягу 30 хвілін.
3. Цэнтрыфугаваць рэакцыйны раствор.
4. Вазьміце 0,5 мл супернатанта, дадайце 2,5 мл рэагента III, 0,5 мл рэагента IV, добра змяшайце і інкубуйце пры 37 ℃.на працягу 30 хвілін.
5. АД660вызначаўся як OD1;пустая кантрольная група: 0,5 мл рэагента V выкарыстоўваецца для замены ферментараствор для вызначэння OD660як OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Стандартная крывая L-тыразіну: 0,5 мл раствора L-тыразіну рознай канцэнтрацыі, 2,5 мл рэагента III, 0,5 мл рэагента IV у цэнтрыфужнай прабірцы аб'ёмам 5 мл, інкубуйце пры 37 ℃ на працягу 30 хвілін, вызначце OD660для рознай канцэнтрацыі L-тыразіну, то атрымліваецца стандартная крывая Y=kX+b, дзе Y — канцэнтрацыя L-тыразіну, X — OD600.
Разлік
2: Агульны аб'ём рэакцыйнага раствора (мл)
0,5: Аб'ём раствора фермента (мл)
0,5: Аб'ём рэакцыйнай вадкасці, які выкарыстоўваецца ў храмагенным вызначэнні (мл)
10: Час рэакцыі (мін)
Df: шматразовае развядзенне
C: Канцэнтрацыя фермента (мг/мл)
Спасылкі
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972 г.);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.біяфіз.Рэз.камун.(1971 г.);44:513.
3. Хільц, Х.і інш.,Эўра.J. Biochem.(1975 г.);56:103–108.
4. Самбрук Джet інш., Малекулярнае кланаванне: лабараторны дапаможнік, 2-е выданне, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Лічбы
Мал.1 Аптымальны pH
100мМ буферны раствор: pH6.0-8.0, Na-фасфат;pH8,0-9,0, Трыс-HCl;pH9,0-12,5, гліцын-NaOH. Канцэнтрацыя фермента: 1 мг/мл
Мал.2 Аптымальная тэмпература
Рэакцыя ў 20 мМ К-фасфатнага буфера рн 8,0.Канцэнтрацыя фермента: 1 мг/мл
Мал.3 pH Стабільнасць
25 ℃, 16 гадзін - апрацоўка 50 мМ буферным растворам: pH 4,5- 5,5, ацэтат;pH 6,0-8,0, Na-фасфат;pH 8,0-9,0, трыс-HCl.pH 9,0- 12,5, гліцын-NaOH.Канцэнтрацыя фермента: 1 мг/мл
Мал.4 Цеплавы стабільнасць
30-хвілінная апрацоўка 50 мМ трис-HCl буферам, pH 8,0.Канцэнтрацыя фермента: 1 мг/мл
Мал.5 Захоўванне стабільныty at 25 ℃
