Набор для генатыпавання мышэй
Кат. №: HCR2021A
Гэты прадукт уяўляе сабой набор, прызначаны для хуткай ідэнтыфікацыі генатыпаў мышэй, уключаючы экстракцыю сырой ДНК і сістэму ПЦР-ампліфікацыі.Прадукт можна выкарыстоўваць для ПЦР-ампліфікацыі непасрэдна з мышынага хваста, вуха, пальца ногі і іншых тканін пасля простага расшчаплення буферам для лізісу і пратэіназай k.Няма начнога пераварвання, экстракцыі фенолам і хлараформам або ачысткі ў калонцы, што проста і скарачае час эксперыментаў.Прадукт прыдатны для ампліфікацыі мэтавых фрагментаў памерам да 2 кб і мультыплексных рэакцый ПЦР з выкарыстаннем да 3 пар праймераў.Сумесь 2×Mouse Tissue Direct PCR Mix змяшчае генна-інжынерную ДНК-палімеразу, Mg2+, dNTP і аптымізаваную буферную сістэму для забеспячэння высокай эфектыўнасці ампліфікацыі і талерантнасці да інгібітараў, так што рэакцыі ПЦР можна праводзіць шляхам дадання шаблону і праймераў і рэгідратацыі прадукту да 1×.ПЦР-прадукт, узмоцнены гэтым прадуктам, мае прыкметную аснову "А" на 3'-канцы і можа выкарыстоўвацца непасрэдна для кланавання ТА пасля ачысткі.
Кампаненты
| Кампанент | Памер |
| 2 × Сумесь для прамой ПЦР мышы | 5×1,0 мл |
| Буфер для лізісу | 2 × 20 мл |
| Пратэіназа К | 800 мкл |
Умовы захоўвання
Прадукты павінны захоўвацца пры -25 ~ -15 ℃ на працягу 2 гадоў.Пасля адтавання лізісны буфер можна захоўваць пры тэмпературы 2~8 ℃ для кароткачасовага шматразовага выкарыстання і добра змяшаць пры выкарыстанні.
Ужыванне
Гэты прадукт падыходзіць для аналізу накаўту ў мышэй, выяўлення трансгенаў, генатыпавання і гэтак далей.
Асаблівасці
1.Простае кіраванне: няма неабходнасці здабываць геномную ДНК;
2.Шырокае прымяненне: падыходзіць для прамога ўзмацнення розных тканін мышэй.
Інструкцыя
1.Вызваленне геномнай ДНК
1) Падрыхтоўка лізата
Тканкавы лізат рыхтуецца ў залежнасці ад колькасці мышыных узораў, якія падлягаюць лізіру (тканкавы лізат трэба рыхтаваць на месцы ў адпаведнасці з дазоўкай і старанна змешваць для выкарыстання), а прапорцыя рэагентаў, неабходных для аднаго ўзору, наступная:
| Кампаненты | Аб'ём (мкл) |
| Пратэіназа К | 4 |
| Буфер для лізісу | 200 |
2) Падрыхтоўка пробы і лізіс
Рэкамендуемае выкарыстанне тканін
| Тыптканіна | Рэкамендаваны аб'ём |
| Мышыны хвост | 1-3 мм |
| Мышынае вушка | 2-5 мм |
| Мышыны палец | 1-2 штукі |
Вазьміце адпаведную колькасць узораў тканіны мышы ў чыстыя цэнтрыфужныя прабіркі, дадайце 200 мкл свежага тканкавага лізата ў кожную цэнтрыфужную прабірку, змяшайце і падтрасіце, затым інкубуйце пры 55 ℃ на працягу 30 хвілін, а затым награвайце пры 98 ℃ на працягу 3 хвілін.
3) Цэнтрыфугаванне
Добра ўзбоўтайце лізат і цэнтрыфугуйце пры 12000 абаротаў у хвіліну на працягу 5 хвілін.Супернатант можна выкарыстоўваць у якасці шаблону для ПЦР-ампліфікацыі.Калі шаблон неабходны для захоўвання, перанясіце супернатант у іншую стэрыльную цэнтрыфужную прабірку і захоўвайце пры -20 ℃ на працягу 2 тыдняў.
2.ПЦР-ампліфікацыя
Зніміце сумесь 2 × Mouse Tissue Direct PCR Mix з тэмпературы -20 ℃ і адтайце на лёдзе, змяшайце ўверх дном і падрыхтуйце рэакцыйную сістэму ПЦР у адпаведнасці з наступнай табліцай (працуйце на лёдзе):
| Кампаненты | 25мклсістэма | 50мклсістэма | Канчатковая канцэнтрацыя |
| 2 × Сумесь для прамой ПЦР мышы | 12,5 мкл | 25 мкл | 1× |
| Праймер 1 (10 мкМ) | 1,0 мкл | 2,0 мкл | 0,4 мкМ |
| Праймер 2 (10 мкМ) | 1,0 мкл | 2,0 мкл | 0,4 мкМ |
| Прадукт расшчапленняa | Як патрабуюць | Як патрабуюць |
|
| ddH2O | Да 25 мкл | Да 50 мкл |
|
нататка:
a) Дададзеная колькасць не павінна перавышаць 1/10 сістэмнай колькасці, і калі будзе дададзена занадта шмат, ПЦР-ампліфікацыя можа быць спынена.
Рэкамендуемыя ўмовы ПЦР
| Цыкл крок | тэмп. | Час | Цыклы |
| Пачатковая дэнатурацыя | 94 ℃ | 5 хвілін | 1 |
| Дэнатурацыя | 94 ℃ | 30 сек | 35-40 |
| Адпалa | Tm+3~5℃ | 30 сек | |
| Пашырэнне | 72 ℃ | 30 с/кб | |
| Канчатковае пашырэнне | 72 ℃ | 5 хвілін | 1 |
| - | 4 ℃ | Трымай | - |
нататка:
a) Тэмпература адпалу: у залежнасці ад значэння Tm праймера, рэкамендуецца ўсталёўваць тэмпературу адпалу на меншае значэнне Tm праймера +3~5℃.
Агульныя праблемы і рашэнні
1.Няма мэтавых палос
1) Празмерны лізіс прадукту.Выберыце найбольш прыдатны аб'ём шаблону, звычайна не больш за 1/10 сістэмы;
2) Занадта вялікі памер выбаркі.Разбавіць лізат у 10 разоў, а затым узмацніць або паменшыць памер пробы і правесці паўторны лізіс;
3) Узоры тканін не свежыя.Рэкамендуецца выкарыстоўваць свежыя ўзоры тканін;
4) Дрэнная якасць грунтоўкі.Выкарыстоўвайце геномную ДНК для ампліфікацыі, каб праверыць якасць праймера і аптымізаваць дызайн праймера.
2.Неспецыфічныя ўзмацненне
1) Тэмпература адпалу занадта нізкая, а колькасць цыклаў занадта вялікая.Павысіць тэмпературу адпалу і паменшыць колькасць цыклаў;
2) Канцэнтрацыя шаблону занадта высокая.Паменшыце колькасць шаблону або развядзіце шаблон у 10 разоў пасля ўзмацнення;
3) Дрэнная спецыфічнасць праймера.Аптымізаваць дызайн грунтоўкі.
Заўвагі
1.Каб пазбегнуць перакрыжаванага забруджвання паміж пробамі, трэба падрыхтаваць некалькі інструментаў для адбору проб, а паверхню інструментаў можна ачысціць 2% растворам гіпахларыту натрыю або ачышчальнікам нуклеінавай кіслаты пасля кожнага ўзяцця проб, калі патрабуецца паўторнае выкарыстанне.
2.Рэкамендуецца выкарыстоўваць свежыя тканіны мышы, а аб'ём пробы не павінен быць занадта вялікім, каб не паўплываць на вынікі ампліфікацыі.
3.Буфер для лізісу павінен пазбягаць частага замарожвання-адтавання, яго можна захоўваць пры тэмпературы 2~8 ℃ для кароткачасовага шматразовага выкарыстання.Пры захоўванні пры нізкай тэмпературы можа ўзнікнуць асадак, і перад ужываннем яго трэба цалкам растварыць.
4.ПЦР-сумесь павінна пазбягаць частага замарожвання-адтавання, яе можна захоўваць пры тэмпературы 4 ℃ для кароткачасовага паўторнага выкарыстання.
5.Гэты прадукт прызначаны толькі для навуковых эксперыментальных даследаванняў і не павінен выкарыстоўвацца ў клінічнай дыягностыцы або лячэнні.
