Пратэіназа K NGS (парашок)
Кат. №: HC4507A
NGS Protease K - гэта стабільная серын-пратэаза з высокай актыўнасцю фермента і шырокай субстратнай спецыфічнасцю. Фермент пераважна расшчапляе складанаэфірныя і пептыдныя сувязі побач з С-канцам гідрафобных амінакіслот, серазмяшчальных амінакіслот і араматычных амінакіслот.Такім чынам, ён часта выкарыстоўваецца для раскладання бялкоў на кароткія пептыды.NGS Protease K - тыповая серын-пратэаза з Asp39-Яго69-Сэр224каталітычная трыяда, унікальная для серынавых пратэаз, і каталітычны цэнтр акружаны жгутам Са2+сайты звязвання для стабілізацыі, падтрымання высокай актыўнасці фермента ў больш шырокім дыяпазоне умоў.
Спецыфікацыя
| Знешні выгляд | Аморфны парашок ад белага да белага, лиофилизированный |
| Канкрэтная дзейнасць | ≥40U/мг цвёрдага рэчыва |
| ДНКаза | Нічога не выяўлена |
| РНКаза | Нічога не выяўлена |
| Біягруз | ≤50CFU/г цвёрдага рэчыва |
| Астатак нуклеінавай кіслаты | <5 пг/мг цвёрдага рэчыва |
Уласцівасці
| Крыніца | Альбом Tritirachium |
| Нумар EC | 3.4.21.64(Рэкамбінант з альбому Tritirachium) |
| Малекулярная маса | 29 кДа (SDS-PAGE) |
| Ізаэлектрычная кропка | 7.81 Мал.1 |
| Аптымальны pH | 7,0-12,0 (Усе праяўляюць высокую актыўнасць) Мал.2 |
| Аптымальная тэмпература | 65 ℃ Мал.3 |
| Стабільнасць pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 гадзін) Мал.4 |
| Тэрмастабільнасць | Ніжэй за 50 ℃ (pH 8,0, 30 хвілін) Мал.5 |
| Стабільнасць пры захоўванні | Захоўваецца пры 25 ℃ на працягу 12 месяцаў Мал.6 |
| Актыватары | SDS, мачавіна |
| Інгібітары | Диизопропилфторфосфат;бензилсульфонилфторид |
Умовы захоўвання
Захоўвайце лиофилизированный парашок пры -25 ~ -15 ℃ на працягу доўгага часу ўдалечыні ад святла;Пасля растварэння разбярыце адпаведны аб'ём для кароткатэрміновага захоўвання пры 2-8 ℃ удалечыні ад святла або працяглага захоўвання пры -25 ~ -15 ℃ удалечыні ад святла.
Меры засцярогі
Апранайце ахоўныя пальчаткі і акуляры пры выкарыстанні або ўзважванні і захоўвайце добрае праветрыванне пасля выкарыстання.Гэты прадукт можа выклікаць скурную алергічную рэакцыю і сур'ёзнае раздражненне вачэй.Пры ўдыханні гэта можа выклікаць сімптомы алергіі або астмы або дыхавіцу.Можа выклікаць раздражненне дыхальных шляхоў.
Вызначэнне адзінкі
Адна адзінка NGS Protease K вызначаецца як колькасць фермента, неабходнага для гідралізу казеіну ў 1 мкмоль L-тыразіну ў стандартных умовах вызначэння.
Падрыхтоўка рэагентаў
| Рэагент | Вытворца | Каталог |
| Казеін тэхнічныз бычынага малака | Сігма Олдрыч | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Трихлоруксусная кіслата | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Ацэтат натрыю | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Воцатная кіслата | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Карбанат натрыю | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Фолін-фенол | Sangon Biotech (Шанхай)ТАА | A500467-0100 |
| L-тыразін | Сігма | 93829 |
Рэагент I:
Субстрат: 1% казеіну з раствора бычынага малака: растварыць 1 г казеіну бычынага малака ў 50 мл 0,1 М раствора фасфату натрыю, pH 8,0, нагрэць на вадзяной лазні пры 65-70 °C на працягу 15 хвілін, змяшаць і растварыць, астудзіць вадой, адрэгуляванай гідраксіду натрыю да рн 8,0 і развядзіце ў 100 мл.
Рэагент II:
Раствор TCA: 0,1 М трыхларацуснай кіслаты, 0,2 М ацэтату натрыю і 0,3 М воцатнай кіслаты (узважце паслядоўна 1,64 г трыхларацуснай кіслаты + 1,64 г ацэтату натрыю + 1,724 мл воцатнай кіслаты, дадайце 50 мл дэіянізаванай вады, давядзіце HCl да pH 4,03 і развядзіце ў 100 мл).
Рэагент III:
0,4 мл раствора карбанату натрыю (узважыць 4,24 г бязводнага карбанату натрыю і растварыць у 100 мл вады)
Рэагент IV:
Фенольны рэактыў Фолін: развесці ў 5 разоў дэіянізаванай вадой.
Рэагент V:
Растваральнік ферментаў: 0,1 М раствор фасфату натрыю, рн 8,0.
Рэагент VI:
Стандартны раствор L-тыразіну: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 мкмоль/мл L-тыразіну, растворанага ў 0,2 М HCl.
Працэдура
1. Уключыце спектрафатометр UV-Vis і абярыце фотаметрычнае вымярэнне.
2. Усталюйце даўжыню хвалі 660 нм.
3. Уключыце вадзяную лазню, выстаўце тэмпературу 37℃, сочыце за тым, каб тэмпература не змянялася 3-5 хвілін.
4. Нагрэйце 0,5 мл субстрата ў цэнтрыфужнай прабірцы аб'ёмам 2 мл на вадзяной лазні пры 37 ℃ на працягу 10 хвілін.
5. Экстрагуйце 0,5 мл разведзенага раствора фермента ў папярэдне нагрэтую цэнтрыфужную прабірку на працягу 10 хвілін.Усталюйце ферментны разбаўляльнік пустой групай.
6. Дадайце 1,0 мл рэагента TCA адразу пасля рэакцыі.Добра змяшаць і вытрымаць на вадзяной лазні 30 хвілін.
7. Центрифугируйте рэакцыйны раствор.
8. Дадайце наступныя кампаненты ў пазначаным парадку.
| Рэагент | Аб'ём |
| Супернатант | 0,5 мл |
| 0,4 М карбанату натрыю | 2,5 мл |
| Фолін фенольны рэактыў | 0,5 мл |
9. Добра змяшайце перад інкубацыяй на вадзяной лазні пры 37 ℃ на працягу 30 хвілін.
10. АД660вызначаўся як OD1;пустая кантрольная група: ферментны растваральнік выкарыстоўваецца замест раствора фермента для вызначэння OD660як OD2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Стандартная крывая L-тыразіну: 0,5 мл раствора L-тыразіну рознай канцэнтрацыі, 2,5 мл 0,4 М карбанату натрыю, 0,5 мл фенольнага рэагента фоліну ў цэнтрыфужнай прабірцы аб'ёмам 5 мл, інкубаваць пры 37 ℃ на працягу 30 хвілін, вызначыць OD660для рознай канцэнтрацыі L-тыразіну, тады атрымліваецца стандартная крывая Y=kX+b, дзе Y — канцэнтрацыя L-тыразіну, X — OD600.
Разлік
2: Агульны аб'ём рэакцыйнага раствора (мл)
0,5: Аб'ём раствора фермента (мл)
0,5: Аб'ём рэакцыйнай вадкасці, які выкарыстоўваецца ў храмагенным вызначэнні (мл)
10: Час рэакцыі (мін)
Df: шматразовае развядзенне
C: Канцэнтрацыя фермента (мг/мл)
Лічбы
Мал.1 Рэшткі ДНК
| Узор | прасп C4 | Нуклеінавая кіслата Аднаўленне (пг/мг) | Аднаўленне (%) | Агульны нуклеін кіслата ( пг/мг) |
| ФРК | 24.66 | 2.23 | 83% | 2,687 |
| PRK+STD2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| STD1 | 12,955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19,125 | |||
| STD4 | 23,135 | |||
| STD5 | 26,625 | |||
| H2O без РНК | Нявызначаны | — | — | — |
Мал.2 Аптымальны pH
Мал.3 Аптымальная тэмпература
Мал.4 Стабільнасць pH
Мал.5 Тэрмастабільнасць
Мал.6 Стабільнасць пры захоўванні пры 25 ℃
