Зваротная транскрыптаза RTL
Зваротная транскрыптаза RTL - гэта залежная ад матрыцы РНК ДНК-палімераза, у якой адсутнічае экзануклеазная актыўнасць 3'→5' і якая валодае актыўнасцю РНКазы Н.Гэты фермент можа выкарыстоўваць РНК у якасці шаблону для сінтэзу камплементарнай ланцуга ДНК, які можа быць ужыты для сінтэзу кДНК першай ланцуга, асабліва для RT-LAMP (ізатэрмічнай ампліфікацыі, апасродкаванай пятлёй).У параўнанні з зваротнай транскрыптазай RTL 1.0 адчувальнасць значна палепшана, тэрмічная стабільнасць мацнейшая, а рэакцыя пры 65°C больш стабільная.Зваротная транскрыптаза RTL (без гліцэрыны) можа быць выкарыстана для падрыхтоўкі лиофилизированных прэпаратаў, лиофилизированных рэагентаў RT-LAMP і г.д.
Вызначэнне адзінкі
Адна адзінка ўключае 1 нмоль dTTP у асаджаны кіслатой матэрыял за 20 хвілін пры 50°C з выкарыстаннем полі(A)•аліга(dT)25 у якасці шаблону-праймера.
Кампаненты
| Кампанент | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Зваротная транскрыптаза RTL (без гліцэрыны) (15U/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 10 мл |
| Буфер 10×HC RTL | 1,5 мл | 4×1,5 мл | 5×10 мл |
| MgSO4 (100 мМ) | 1,5 мл | 2×1,5 мл | 3×10 мл |
Умовы захоўвання
Транспарціроўка пры тэмпературы ніжэй за 0°C і захоўванне пры тэмпературы ад -25°C~-15°C.
Кантроль якасці
- Рэшткавы актыўнасцьEндануклеаза:Рэакцыя аб'ёмам 50 мкл, якая змяшчае 1 мкг λДНК і 15 адзінак RTL2.0, інкубаваная на працягу 16 гадзін пры 37 ℃, дэманструе тую ж карціну, што і адмоўны кантроль пры электрафарэзе ў гелі.
- Рэшткавы актыўнасцьЭкзануклеаза:Рэакцыя аб'ёмам 50 мкл, якая змяшчае 1 мкг расшчапленай λДНК Hind Ⅲ і 15 адзінак RTL2.0, інкубаваная на працягу 16 гадзін пры 37 ℃, дэманструе тую ж карціну, што і адмоўны кантроль пры электрафарэзе ў гелі.
- Рэшткавы актыўнасцьНікасэ:Рэакцыя аб'ёмам 50 мкл, якая змяшчае 1 мкг суперскручанага pBR322 і 15 адзінак RTL2.0, інкубаваная на працягу 4 гадзін пры 37°C, дэманструе тую ж карціну, што і адмоўны кантроль пры электрафарэзе ў гелі.
- Рэшткавы актыўнасцьРНКаза:Рэакцыя аб'ёмам 10 мкл, якая змяшчае 0,48 мкг РНК MS2 і 15 адзінак RTL2.0, інкубаваная на працягу 4 гадзін пры 37 °C, дэманструе тую ж карціну, што і адмоўны кантроль пры электрафарэзе ў гелі.
- Кішачная палачка gДНК:Вымяраецца сКішачная палачкаспецыяльныя камплекты выяўлення HCD，15 адзінак RTL2.0 змяшчае менш за 1Кішачная палачкагеном.
Налада рэакцыі
Пратакол сінтэзу кДНК
| Кампаненты | Аб'ём |
| Матрычная РНК а | неабавязковы |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) або Random Primer mix (60uM) | 2 мкл |
| Сумесь dNTP (10 мМ кожны) | 1 мкл |
| Інгібітар РНКазы (40U/мкл) | 0,5 мкл |
| Зваротная транскрыптаза RTL 2.0 (15U/мкл) | 0,5 мкл |
| Буфер 10×HC RTL | 2 мкл |
| Безнуклеазная вада | Да 20 мкл |
Заўвагі:
1) Рэкамендуемая доза Total RNA складае 1 нг~1 мкг
2) Рэкамендуемая доза мРНК складала 50 ~ 100 нг
Тэрма-язда на ровары Умовы для руціны рэакцыя:
| Тэмпература (°C) | Час |
| 25 °Ca | 5 хвілін |
| 55 °C | 10 хвілінb |
| 80 °C | 10 хвілін |
Заўвагі:
1) Калі выкарыстоўваецца Random Primer Mix, этап інкубацыі пры 25°C.
2) Калі выкарыстоўваецца мэтавая сумесь праймераў, этап інкубацыі пры 55°C на працягу 10~30 хвілін.
Пратакол RT-LAMP
| Кампаненты | Аб'ём | Канчатковая канцэнтрацыя |
| Матрычная РНК | неабавязковы | ≥10 асобнікаў |
| Сумесь dNTP (10 мМ) | 3,5 мкл | 1,4 мм |
| Праймеры FIP/BIP (25×) | 1 мкл | 1,6 мкМ |
| Праймеры F3/B3 (25×) | 1 мкл | 0,2 мкМ |
| Праймеры LoopF/LoopB (25×) | 1 мкл | 0,4 мкМ |
| Інгібітар РНКазы (40U/мкл) | 0,5 мкл | 20 U/Рэакцыя |
| Зваротная транскрыптаза RTL 2.0 (15U/мкл) | 0,5 мкл | 7.5 U/Рэакцыя |
| ДНК-палімераза Bst V2 (8U/мкл) | 1 мкл | 8 У/Рэакцыя |
| MgSO4 (100 мМ) | 1,5 мкл | 6 мм (усяго 8 мм) |
| Буфер 10×HC RTL (або буфер 10×HC Bst V2) | 2,5 мкл | 1 × (2 мМ Mg2+) |
| Безнуклеазная вада | Да 25 мкл | - |
Заўвагі:
1) Змяшайце на вортексе і ненадоўга адцэнтрыфугуйце, каб сабраць.Інкубацыя пры пастаяннай тэмпературы пры 65°C на працягу 1 гадзіны.
2) Два буферы сумяшчальныя і маюць аднолькавы склад.
Заўвагі
1. Гэты прадукт будзе ўтвараць белае цвёрдае рэчыва пры захоўванні пры -20 °C.Дастаньце яго з -20 ° C і пакладзеце на лёд прыкладна на 10 хвілін.Пасля раставання яго можна выкарыстоўваць, боўтаючы і змешваючы.
2. Прадукт кДНК можа захоўвацца пры -20°C або -80°C або неадкладна выкарыстоўвацца для рэакцыі ПЦР.
3. Каб прадухіліць заражэнне РНКазой, падтрымлівайце эксперыментальную зону ў чысціні і надзявайце чыстыя пальчаткі і маскі падчас працы.
