Універсальны прэмікс SYBR GREEN qPCR (сіні)
Кат. №: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (на аснове фарбавальніка) - гэта папярэдні раствор для колькаснай ПЦР-ампліфікацыі 2 × у рэжыме рэальнага часу, які характарызуецца высокай адчувальнасцю і спецыфічнасцю, мае сіні колер і мае эфект адсочвання дабаўленага ўзору.Асноўны кампанент Taq ДНК-палімераза выкарыстоўвае гарачы старт антыцелаў для эфектыўнага інгібіравання неспецыфічнай ампліфікацыі з-за адпалу праймера падчас падрыхтоўкі ўзору.У той жа час формула дадае спрыяльныя фактары для павышэння эфектыўнасці ампліфікацыі рэакцыі ПЦР і выраўноўвання ампліфікацыі генаў з розным утрыманнем GC (30 ~ 70%), так што колькасная ПЦР можа атрымаць добрую лінейную залежнасць у шырокім колькасным дыяпазоне. вобл.Гэты прадукт утрымлівае спецыяльны пасіўны эталонны фарбавальнік ROX, які прымяняецца да большасці прыбораў кПЦР.Няма неабходнасці рэгуляваць канцэнтрацыю ROX на розных інструментах.Неабходна толькі дадаць праймеры і шаблоны, каб падрыхтаваць рэакцыйную сістэму да ампліфікацыі.
Кампаненты
Universal Blue qPCR Master Mix
Умовы захоўвання
Прадукт пастаўляецца з пакетамі з лёдам і можа захоўвацца пры -25℃~-15℃ на працягу 18 месяцаў.Неабходна пазбягаць моцнага светлавога апраменьвання пры захоўванні або падрыхтоўцы рэакцыйнай сістэмы.
Спецыфікацыя
| Канцэнтрацыя | 2× |
| Спосаб выяўлення | СІБР |
| Метад ПЦР | кПЦР |
| Палімераза | Taq ДНК-палімераза |
| Тып выбаркі | ДНК |
| Нанясенне абсталявання | Большасць інструментаў кПЦР |
| Тып вырабы | Прэмікс SYBR для колькаснай ПЦР з флуарэсцэнцыяй у рэальным часе |
| Прымяніць да (дадатак) | Экспрэсія генаў |
Інструкцыя
1.Сістэма рэакцыі
| Кампаненты | Аб'ём (мкл) | Аб'ём (мкл) | Канчатковая канцэнтрацыя |
| Універсальны прэмікс SYBR GREEN qPCR | 25 | 10 | 1× |
| Forward Primer (10 мкмоль/л) | 1 | 0,4 | 0,2 мкмоль/л |
| Зваротны праймер (10 мкмоль/л) | 1 | 0,4 | 0,2 мкмоль/л |
| ДНК | X | X | |
| ddH2O | да 50 | да 20 | - |
[Заўвага]: Старанна змяшайце перад ужываннем, каб пазбегнуць празмернага ўтварэння бурбалак ад інтэнсіўнага ўстрэсвання.
a) Канцэнтрацыя праймера: Канчатковая канцэнтрацыя праймера складае 0,2 мкмоль/л і можа быць адрэгулявана ў межах ад 0,1 да 1,0 мкмоль/л у залежнасці ад неабходнасці.
b) Канцэнтрацыя шаблону: калі матрыцай з'яўляецца неразведзены зыходны раствор кДНК, выкарыстоўваны аб'ём не павінен перавышаць 1/10 ад агульнага аб'ёму рэакцыі кПЦР.
в) Матрычнае развядзенне: рэкамендуецца разбавіць асноўны раствор кДНК у 5-10 разоў.Аптымальная колькасць дададзенага шаблону лепш, калі значэнне Ct, атрыманае шляхам ампліфікацыі, складае 20-30 цыклаў.
d) Рэакцыйная сістэма: рэкамендуецца выкарыстоўваць 20 мкл або 50 мкл, каб забяспечыць эфектыўнасць і паўтаральнасць ампліфікацыі мэтавага гена.
e) Падрыхтоўка сістэмы: рыхтуйцеся ў звышчыстай лаўцы і выкарыстоўвайце наканечнікі і рэакцыйныя прабіркі без рэшткаў нуклеазы;рэкамендуецца выкарыстоўваць наканечнікі з фільтруюць картрыджамі.Пазбягайце перакрыжаванага і аэразольнага забруджвання.
2.Праграма рэакцыі
Стандартная праграма
| Цыкл крок | тэмп. | Час | Цыклы |
| Пачатковая дэнатурацыя | 95 ℃ | 2 хв | 1 |
| Дэнатурацыя | 95 ℃ | 10 сек | 40 |
| Адпал/Пашырэнне | 60 ℃ | 30 секунд★ | |
| Стадыя крывой плаўлення | Налады інструмента па змаўчанні | 1 | |
Хуткая праграма
| Цыкл крок | тэмп. | Час | Цыклы |
| Пачатковая дэнатурацыя | 95 ℃ | 30 сек | 1 |
| Дэнатурацыя | 95 ℃ | 3 сек | 40 |
| Адпал/Пашырэнне | 60 ℃ | 20 секунд★ | |
| Стадыя крывой плаўлення | Налады інструмента па змаўчанні | 1 | |
[Заўвага]: хуткая праграма падыходзіць для пераважнай большасці генаў, а стандартныя праграмы можна паспрабаваць для асобных складаных генаў другаснай структуры.
a) Тэмпература і час адпалу: Адрэгулюйце ў залежнасці ад даўжыні праймера і мэтавага гена.
b) Атрыманне сігналу флуарэсцэнцыі (★): усталюйце эксперыментальную працэдуру ў адпаведнасці з патрабаваннямі інструкцыі па выкарыстанні прыбора.
c) Крывая плаўлення: Праграма прыбора па змаўчанні можа выкарыстоўвацца ў звычайным рэжыме.
3. Аналіз вынікаў
Для колькасных эксперыментаў патрабавалася як мінімум тры біялагічныя паўторы.Пасля рэакцыі неабходна пацвердзіць крывую ампліфікацыі і крывую плаўлення.
3.1 Крывая ўзмацнення:
Стандартная крывая ўзмацнення мае S-вобразную форму.Колькасны аналіз найбольш дакладны, калі значэнне Ct знаходзіцца ў межах ад 20 да 30. Калі значэнне Ct менш за 10, неабходна разбавіць шаблон і правесці тэст паўторна.Калі значэнне Ct знаходзіцца ў межах 30-35, неабходна павялічыць канцэнтрацыю шаблону або аб'ём рэакцыйнай сістэмы, каб палепшыць эфектыўнасць узмацнення і забяспечыць дакладнасць аналізу вынікаў.Калі значэнне Ct больш за 35, вынікі тэсту не дазваляюць колькасна прааналізаваць экспрэсію гена, але могуць быць выкарыстаны для якаснага аналізу.
3.2 Крывая плаўлення:
Адзіны пік крывой плаўлення паказвае на тое, што спецыфічнасць рэакцыі добрая і можна правесці колькасны аналіз;калі крывая плаўлення паказвае падвойныя або некалькі пікаў, колькасны аналіз не можа быць выкананы.Крывая плаўлення паказвае двайныя пікі, і неабходна меркаваць, ці з'яўляецца нямэтавы пік дымерам праймера або неспецыфічнай ампліфікацыяй з дапамогай электрафарэзу ў ДНК-агарозным гелі.Калі гэта дымер праймера, рэкамендуецца паменшыць канцэнтрацыю праймера або перарабіць праймер з высокай эфектыўнасцю ўзмацнення.Калі гэта неспецыфічная ампліфікацыя, калі ласка, павялічце тэмпературу адпалу або змяніце праймеры са спецыфікай.
Заўвагі
Калі ласка, апранайце неабходныя сродкі індывідуальнай абароны, такія як лабараторны халат і пальчаткі, каб гарантаваць ваша здароўе і бяспеку！
Гэты прадукт прызначаны ТОЛЬКІ для даследчага выкарыстання!
