ДНК-палімераза Hotstart Taq
ДНК-палімераза Hot Start Taq (мадыфікацыя антыцелаў) - гэта тэрмастабільная ДНК-палімераза гарачага старту з Thermus aquaticus YT-1, якая валодае палімеразнай актыўнасцю 5′→3′ і эндануклеазнай актыўнасцю 5′-лоскута.ДНК-палімераза Taq з гарачым стартам - гэта ДНК-палімераза Taq, мадыфікаваная тэрмалабільнымі антыцеламі Taq.Мадыфікацыя антыцелаў павялічвала спецыфічнасць, адчувальнасць і вынік ПЦР.
Кампаненты
| Кампанент | HC1012А-01 | HC1012А-02 | HC1012А-03 | HC1012А-04 |
| 5×HC Taq буфер | 4×1 мл | 4×10 мл | 4×50 мл | 5×400 мл |
| ДНК-палімераза Hot Start Taq (мадыфікаваныя антыцелы) (5 ЕД/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 5 мл | 10×5 мл |
Прыкладанні
10 мм Tris-HCl (pH 7,4 пры 25 ℃), 100 мм KCl, 0,1 мм ЭДТА, 1 мм дитиотреитол, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 і 50% гліцэрыны.
Умовы захоўвання
Транспарціроўка пры тэмпературы ніжэй за 0°C і захоўванне пры тэмпературы ад -25°C~-15°C.
Вызначэнне адзінкі
Адна адзінка вызначаецца як колькасць фермента, які ўключае 15 нмоль dNTP у нерастваральны ў кіслаце матэрыял за 30 хвілін пры 75°C.
Кантроль якасці
1.EndАктыўнасць onuclease:Інкубацыя 20 ЕД фермента з 4 мкг pUC19 ДНК на працягу 4 гадзін пры 37 ℃ не прывяла да выяўленай дэградацыі ДНК, вызначанай электрафарэзам у гелі.
2.5 кб Лямбда ПЦР:25 цыклаў ПЦР-ампліфікацыі 5 нг лямбда-ДНК з 1,25 адзінкамі ДНК-палімеразы Taq у прысутнасці 200 мкМ dNTP і 0,2 мкМ праймераў прыводзяць да чаканага прадукту памерам 5 кб.
3.Актыўнасць экзонуклеазы:Інкубацыя 50 мкл рэакцыі, якая змяшчае мінімум 12,5 ЕД ДНК-палімеразы Taq з 10 нмоль алігануклеатыду 5´-FAM, на працягу 30 хвілін пры 37 ℃ не прыводзіць да выяўленай дэградацыі.
4.Актыўнасць РНКазы:Інкубацыя 10 мкл рэакцыі, якая змяшчае 20 ЕД фермента з 1 мкг транскрыптаў РНК, на працягу 2 гадзін пры 37 °C не прывяла да выяўленай дэградацыі РНК, вызначанай электрафарэзам у гелі.
5.Цеплавая інактывацыя:няма
Сістэма рэакцыі
| Кампаненты | Аб'ём |
| Шаблон ДНКa | неабавязковы |
| 10 мкМ Forward Primer | 0,5 мкл |
| 10 мкМ Зваротны праймер | 0,5 мкл |
| Сумесь dNTP (10 мМ кожны) | 0,5 мкл |
| 5×HC Taq буфер | 5 мкл |
| Taq ДНК-палімеразаб(5U/мкл) | 0,125 мкл |
| Безнуклеазная вада | Да 25 мкл |
Заўвагі:
1) а.
| ДНК | Сума |
| Геномная | 1 нг-1 мкг |
| Плазміда або вірус | 1 пг-1 нг |
2) б.Аптымальная канцэнтрацыя ДНК-палімеразы Taq можа вагацца ад 5-50 адзінак/мл (0,1-0,5 адзінак/25 мкл рэакцыі) у спецыялізаваных прымяненнях.
Пратакол цеплавога цыклу
ПЦР
| Крок | тэмпература(°C) | Час | Цыклы |
| Пачатковая дэнатурацыяa | 95 ℃ | 1-3 хвіліны | - |
| Дэнатурацыя | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 цыклаў |
| Адпалб | 45-68 ℃ | 15-60 с | |
| Пашырэнне | 68 ℃ | 1кб/хв | |
| Канчатковае пашырэнне | 68 ℃ | 5 хвілін | - |
Заўвагі:
1) Першапачатковай дэнатурацыі ў 1 хвіліну пры 95°C дастаткова для большасці ўзмацненняў.Для складаных шаблонаў рэкамендуецца больш працяглая дэнатурацыя 2-3 хвіліны пры 95°C.Пры ПЦР калоніі рэкамендуецца першапачатковая 5-хвілінная дэнатурацыя пры 95°C.
2) Крок адпалу звычайна складае 15-60 с.Тэмпература адпалу заснавана на Tm пары праймераў і звычайна складае 45-68 ℃.
